洋葱中非挥发性农药残留的定性与定量筛查

摘要本应用简报采用一种基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱平台的数据非依赖型采集方法，结合固相萃取净化和农药高分辨精确质量数据库与谱图库查询的多农残分析策略，开展 2020 年度欧盟农药残留检测能力验证项目中关于洋葱基质中无清单农药的定性筛查和基于清单农药的定量筛查（EUPT-SM12 和 EUPT-FV22）。基于欧盟定量筛查清单中适合电喷雾离子化的 173 种农药，在洋葱基质中对该分析方法进行验证。结果表明，该方法对其中 165 种农药的筛查限、定量限、线性、加标回收率和精密度均较为满意，满足对这些农药定性筛查和准确定量测定的方法合格性要求。应用所述方法对 SM12 和FV22 样品进行测试。结果发现，所筛查出的农药化合物与组织方添加的农药一致，无假阳性和假阴性，并且对于要求定量筛查的 FV22 样品的定量结果准确，表明该方法能够满足欧盟关于农药非靶向定性筛查和基于清单化合物的定量筛查的要求。

前言目前有超过 1000 种农药用于防治农作物的病虫草害，不当使用会导致农药残留于各类农产品中，可能对消费者的健康构成潜在威胁。因此，食用农产品中的农药残留一直是全球监管机构监测的重点。为确保监测结果的可靠性，依据欧盟法规 396/2005/EC，所有在欧盟法规控制框架下的农残检测实验室每年均需要参加由欧盟健康与消费者保护委员会 (DG-SANCO) 组织的农残能力测试。欧盟参比实验室 (EURL) 根据欧盟法规 Reg. 882/2004/EC代表 DG-SANCO 组织年度关于农残检测的能力验证项目（简称EUPT）。该验证项目有助于了解相关检测实验室的检测数据质量、准确度以及各实验室间的可比性。欧盟域外实验室经 DGSANCO 许可后可以参加该能力验证项目。目前，色谱-三重四极杆串联质谱法仍是农残检测的方法。但使用该方法时，需要针对每种化合物预先编辑其待采集的特征离子对；再者，由于分辨率较低，使得利用三重四极杆质谱进行检测时可能出现假阳性；另外，能够检测的农药数量也受到仪器扫描速率的限制，且无法对采集清单之外的农药进行检测。因此，为了提高复杂基质中农药残留的检测能力，并实现对采集清单外的农药进行回溯性筛查，我们在过去十余年中一直致力于采用色谱-高分辨质谱联用手段来开展农产品中的农药残留筛查。相继开发出用于苹果、番茄、紫甘蓝、芒果、香蕉、棉籽壳等各类农产品基质中农药残留的高通量定性筛查与准确定量方法[1-4]。

本应用简报介绍了 2020 年度参与 EUPT 关于洋葱基质中的农药筛查与测定的结果。基于 2020 年度欧盟定量筛查清单中适合电喷雾离子化的 173 种农药，在洋葱基质中对实验室开发的多农残同时定性筛查与准确定量的策略与方法[2] 进行筛查限、定量限、线性、加标回收率和精密度等方法性能评价；然后利用该方法对EUPT-SM12 和 EUPT-FV22 样品进行筛查。所筛查出的农药种类和定量结果与欧盟组织方公布的添加农药种类及含量一致，表明所开发的多农残筛查与定量方法准确可靠，能够满足欧盟对农药残留的非靶向筛查和准确定量监测的要求。

实验部分试剂和样品所有 173 种农药标准品均购自天津阿尔塔科技有限公司，纯度≥ 98%；甲酸和醋酸铵均为 LC/MS 级，购自美国 Merck 公司；乙腈和甲苯均为色谱纯，购自美国 Fisher 公司；乙酸、无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯，购自北京化学试剂公司；EUPT-SM12（简称“SM12”）和 EUPT-FV22（简称“FV22”）样品由 EUPT 组织方提供。用于方法学评价的洋葱样品基质购自本地市场。

仪器和设备采用 Agilent 1290 Infinity II 二元液相色谱系统对农药化合物进行超高效分离。该色谱系统配备如下安捷伦模块：1290 Infinity II 二元高压梯度泵、1290 Infinity II 自动进样器和 1290 Infinity II 柱温箱。色谱柱的流出液转入 Agilent 6545A 四极杆飞行时间质谱仪进行检测。实验所用的 Carbon/NH2 固相萃取小柱（500 mg/500 mg，部件号 12252202）为美国安捷伦公司产品，所用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm，部件号861775-902）。

定性筛查EUPT 组织方提供的 SM12 样品仅要求提供定性筛查结果，FV22样品则要求基于 EUPT 提供的清单同时提供定性和定量筛查结果。因此，实验首先对这两种样品按上述样品前处理方法进行处理，得到待测溶液；然后采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱平台在全离子 MS/MS 模式下采集数据，对采集得到的结果进行定性筛查。对于 SM12 样品，依据实验室现有的农药化合物精确质量数据库与谱库（农药 PCDL 库，包含超过 810 种化合物）进行分子式查找，同时选择碎片离子进行确认。对于 FV22 定量筛查样品，则在实验室现有的农药 PCDL 库的基础上，建立针对 FV22 筛查清单的 PCDL 子库，然后利用该 PCDL 子库进行母离子（定量离子）查找以及碎片离子确认。定性筛查指标参考SANTE/12682/2019 指南[6] 并进行适当调整，化合物的确认需要满足以下条件：包括 1 个母离子和至少 1 个碎片离子，且这些离子的质量偏差需要在 10 ppm 以内；母离子与碎片离子共流出，且保留时间与库中标准物质在相同色谱条件下的保留时间偏差在0.35 min 以内。对于质量偏差在 5–10 ppm 以内的化合物，则需进一步人工查验确认。方法的筛查限 (SDL) 基于上述筛查指标要求，采用本地市场采购的无阳性检出的洋葱样品作为空白基质，分别以 1、5、10、25和 50 µg/kg 的浓度水平进行 173 种农药的加标测试。每个浓度水平做 20 组平行实验，经图 1 所示的样品提取与净化过程，在本文所述的色谱和质谱条件下进行测定，并按上述化合物确认需要满足的条件进行筛查阈值的设置。如果某个浓度水平下有 95%或以上的样品中筛查出某种目标化合物，则认为该浓度为此化合物的筛查限。

定量测定对于定量限和线性范围的确定，首先按照图 1 制备空白基质，在最后一步溶解残渣时向其中加入不同浓度的标准溶液，制备成1、5、10、25、50、100、200 μg/kg 的基质匹配标准校正溶液，然后进行样品测定。选择分子加合离子峰（母离子）计算 S/N。将 S/N 满足 ≥ 10 所对应的低加标浓度水平定为目标化合物的定量限 (LOQ)；并以母离子的提取色谱峰面积对添加浓度进行作图，得到基质匹配标准校正曲线。采用空白洋葱样品作为验证基质，分别在 1 × LOQ、2 × LOQ 和10 × LOQ 三个浓度水平进行加标回收实验，每个浓度水平平行测定 5 次，用以评估方法的准确度和精密度。对于定性筛查小节中在 FV22 样品中定性筛查得到的农药，以上述基质匹配标准校正曲线对筛查到的农药进行准确定量。

结果与讨论2020 年度欧盟农残能力验证中的 FV22 项目是基于欧盟公开的农药清单（2020 年度的清单包括 208 种强制农药清单和 36 种自愿农药清单，共 244 种）的筛查与准确定量。利用本实验室基于LC-QTOF/MS 平台所开发的检测方法，首先开展针对欧盟清单化合物的定性和定量筛查方法评价。在上述包含 244 种化合物的清单中，利用根据化合物结构判断适合电喷雾正离子模式离子化特征的 173 种农药，对定性和定量筛查方法的性能进行评价。其它71 种化合物适合电喷雾负离子模式离子化或 EI 离子化，不在本文讨论的范围内。

方法的筛查限 (SDL)、定量限 (LOQ) 与标准曲线按照前述筛查限测定的方法，得到 173 种农药化合物的筛查限如图 2A 中以“×”标记的数据点所示。其中 96.5%（167 种）的农药的筛查限在 1–5 µg/kg 范围内，且有 132 种 (76.3%) 农药的筛查限不高于 1 µg/kg。其余 6 种 (3.5%) 农药的筛查限相对较高，其中 5 种农药（保棉磷、丙硫磷、氟胺氰菊酯、甲基立枯磷和仲丁威）的筛查限在 25 µg/kg 的水平，1 种农药（异噁唑草酮）的筛查限在 50 µg/kg 的水平。表明该方法对于测试清单中适用电喷雾正离子化的绝大部分农药的筛查灵敏度较高，满足欧盟对于这些农药筛查的 10 µg/kg 的一律标准，以及针对个别化合物（例如乐果、氧乐果和毒死蜱等）的更低的标准 (3–5 µg/kg)。173 种农药的定量限如图 2A 中以“o”标记的数据点所示。从图中可以看出，上述 SDL 在 1–5 µg/kg 范围内的 167 种农药的 LOQ均不高于 10 µg/kg 的一律标准和针对个别化合物的更低的标准；且上述筛查限较高的 6 种农药中的两种（保棉磷和仲丁威）的LOQ 在 25 µg/kg 水平，其余 4 种农药的 LOQ 则不高于 50 µg/kg。基质加标溶液测定的结果表明，所考察的农药化合物在测定浓度范围内线性关系良好，超过 90% 的农药化合物的线性回归方程决定系数 R2 均大于 0.99，个别化合物的 R2 略低于 0.99，但均大于0.98，如图 2B 所示。