采用干血斑技术结合超高效液相色谱简化药代 动力学分析

摘要 本应用简报介绍了 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统与 Agilent 6460A 三重串联四极杆 LC/MS 系统联用的分析性能。 内容包括： • 采用干血斑（DBS）技术在仅 15 µL 的全血中提取一系列药物 • 采用新型 ZORBAX 超高压快速高分离度（RRHD）亚 2 µm 粒径色谱柱在接近 1200 bar 的反压下进行快速色谱/质谱分离 • 在不到 50 秒的时间内实现七种小分子药物混合物的高效分离的检测灵敏度

引言 采用 LC/MS/MS 技术进行生物分析中的定量 检测可能被认为是药代动力学（PK）筛查的里 程碑。临床前在体内药物筛查包括以先导化合 物向大量动物（一般为小鼠或大鼠）给药，并监 测动物血清中的药物随时间的吸收和衰减。现 在，在早期药物发现阶段即需进行 PK 分析， 这样就能够以预先找出最有可能通过后续药物 开发阶段的新型化合物（NCE），并针对它展开 接下来的工作。然而，考虑到可能面对的大量 的 NCE，必须尽早迅速、廉价地剔除其中的非 药物化合物，因此需要很短的样品处理周期1。 “盒式给药法”（又名“鸡尾酒”或 “N-inone”）是一种广泛用于加快 PK 筛查的 给药方法。是指以几种药物对同一实验动物进行 同步给药。这种平行测试方法有利于减少动物消 耗、动物处理、以及样品制备和分析时间。还可 以平息伦理上的争议，并可节约相当的成本1-4。 本文对含有六种药物的组合药物进行了 LC/MS/MS 生物分析。主要目的是得到不牺牲 色谱分离度和/或灵敏度前提下的最高分析性 能。研究中使用了一台配备 RRHD 短柱（50 x 2.1 mm ID，1.8 µm）的 Agilent 1290 Infinity LC 系统，在柱压为 1200 bar 时，流速最高可 达 2 mL/min5。该 LC 系统与 6460A 三重串联 四极杆 LC / MS 联用可提供灵敏度以及高 流速条件下无需分流即可进行质谱分析的能力。 安捷伦喷射流技术可以提供上述的高流速6。采用干血斑（DBS）技术7-10 从小体积全血样 品中提取组合药物。与传统的临床前和临床分 析血浆取样技术相比，DBS 技术有其优 点。例如，在临床前研究实验室，由于制备 DBS 样本对血液量的要求较低，因此在实验 动物数量减少的情况下仍然能够实现连续采 血，这有助于消除个体差异。除相关的伦理和 费用方面的优势外，该技术还可提高 PK 数据 的质量。

实验部分 试剂 所有标准品（右美沙芬、维拉帕米、甲氧戊脉 安、丙咪嗪、普罗替林和曲米帕明 （ISTD）、甲酸（FA）、 均购自 Sigma-Aldrich 公司（德国）。HPLC 级水购自 Burdick & Jackson 公司（美国）。 HPLC 级乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）购自 Merck 公司（德国）。 样品制备 用乙腈/水（50:50 V/V）将各化合物分别制备成 约 2 mg/mL 的溶液。将这七种储备液 I 混合， 使其中六种待测药物浓度相等（100µg/mL）， 得到储备液 II。将储备液 II 稀释得到空白和浓 度在 0.5ng/mL 到 5000ng/mL 范围内的一系 列标准溶液。在 90µL 大鼠血中加入10µL 不同 浓度的标准溶液，得到相应的空白和浓度为 0.05ng/mL 到 500ng/mL 的样品溶液。

DBS 提取步骤 FTA Elute MicroCard（FTA 卡）购自 Whatman （英国）。图 1 显示了 15µL 的血液加标样品 的干血斑（左）。用 Harris Uni-Core 打孔器 （Sigma-Aldrich，德国）从干血斑上取下 6mm 直径的样品点。如图 1 所示，打孔器取样后血 斑边缘仍然存在（右）。样品点被放入一个 2ml 离心管中，加 100µL 的乙腈/水 60:40 v/v （2% FA）。涡流混合几秒后，超声提取 15 分 钟。在 15000 rpm 下离心后，将血斑提取液转 移到干净的样品瓶。为了简化样品制备过程， 不对 60% 的乙腈提取物进行复溶和稀释，而是 直接向 LC/MS 系统进样。

设备 • Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统，由内置 脱气机的 1290 Infinity 二元泵、带温控器的 Infinity 1290 自动进样器和 1290 Infinity 柱 温箱组成 • 采用安捷伦喷射流技术的 Agilent 6460A 三 重串联四极杆的 LC/MS 系统 • 安捷伦 MassHunter Workstation 软件，用 于仪器控制、数据采集和数据处理 • 安捷伦 MassHunter Optimizer 软件 • 安捷伦超高压快速高分离度（RRHD） ZORBAX Eclipse Plus - C18 色谱柱， 2.1 x 50mm，1.8µmAgilent 1290 Infinity 方法 溶剂 A： 水 [0.1%甲酸] 溶剂 B： 甲醇 [0.1%甲酸] 梯度： t (min) % B 0 40 1 60 1.2 90 1.7 90 1.9 40 流速： 1 mL/min T (色谱柱)： 50°C 停止时间： 2 分钟 后运行时间： 1 分钟 进样量： 3 µL 洗针： 15 秒 乙腈/水 60/40 v/v （0.1% TFA）

Agilent 6460A 三重串联四极杆 LC/MS 工作条件 扫描模式：MRM（采用 MassHunter Optimizer 软件得到表 1 中的参数设置） 电离方式：采用安捷伦喷射流技术的正离子 ESI 干燥气温度： 300°C 干燥气流量： 11 L/min 雾化器压力： 35 psig 毛细管电压： 2250 V 鞘气温度： 400°C 鞘气流量： 12 L/min 喷嘴电压： 0 V

结果与讨论 高通量的组合给药样品分析 在复杂样品分离中实现高通量常需要在分析速 度和分离质量（即色谱分离度，Rs ）两方面进 行权衡。图 2（A）说明了当前组合给药样品 中相邻峰之间的分离度同流速之间的关系。在 此图中，保持梯度洗脱时间不变，逐次将流动 相流速调高。（研究表明在梯度洗脱时间不变 时，提高流速可得到更好的分离度11）。测试 范围为 0.6 mL/min 到 1.75 mL/min，相应的 最高柱压（pmax）为 470 bar 到 1160 bar； 图 2（A）中也显示了柱压和流速的关系。 最高的流速可产生极快的分离速度，如图2（B） 所示，流速为 1.75 mL/min 时保留化合 物的保留时间仅为 27 秒（曲米帕明，7 号峰）。 即使对于“单化合物”分析，这样的速度也意 味着分析通量。然而在组合给药的样品 分析中，这种超快的流速是以牺牲分离度为代 价的。正如图中所示的甲氧戊脉安和丙咪嗪这 一对接近的峰（图 2 中的峰对 3/4）的分离 度。注：已报道的盒式给药研究往往忽略了色 谱分离的需要，以避免离子抑制效应。

然而，图 2（A）表明，先进的技术使得快速且 高品质的分离成为可能。流速在 0.6 mL/min 到 1 mL/min 之间时，大多数相邻峰都没有出 现明显的分离度变化，即使是接近的峰对 （3/4），在 1 mL/min 时分离度仍可达到 1 左右。图 3 中的重叠 MRM 色谱图显示七个混 合物标样可在 1 分钟内实现色谱分离（流速 1 mL/min；pmax = 740 bar；通常 Rs 大于 1； RTmax 等于 42 秒）。相应的分析时间为 3 分 钟，该分析时间可与“单化合物”PK 分析相近 （通常需要 3 到 5 分钟），而盒式给药样品分析 往往需要更长的分析时间（不小于 6 分钟）2-9。