三重四极杆质测定人空白血清中的内源性类固醇

 在本研究中，对人空白血清中的 13 种主要的类固醇进行了定量分析（见图 1 和表 1）。一些类固醇在负离子模式下有较好的响应 – 如硫酸脱氢表雄酮 (DHEAS) 会在溶液中形成阴离子。并且，具有酚结构的类固醇，如雌二醇、雌三醇和雌素酮在正离子模式下失去一个水分子，并在负离子模式下形成更碎片离子。其余的类固醇在正离子模式下有更高的检测灵敏度。本文展示了一个在单次运行中通过正/负离子模式切换定量分析人血清中主要内源性类固醇的强大、高灵敏度、可靠和快速的 LC-MS/MS液质联用仪 方法。该定量方法在人血清分析中展现出了宽动态范围、优良的线性、准确度和重现性。

实验部分样品制备：样品信息：十三种类固醇标准品和四种同位素标记的内标物（购自Cerilliant 公司）列于表 1。血清样品制备：将 250 µL 人空白血清（购自 UTAK Laboratories 公司）与 500 µL 乙腈混合，涡旋 1 min 后以 10000 rpm 的转速离心 4 min。移取 500 µL 上清液并用 500 µL 水稀释。在随后的稀释中，将该最终提取液用作血清基质。纯溶剂和血清基质中的校准曲线：DHEA、雌酮、雌二醇和雌三醇的校准范围为 0.05 - 500 ng/mL。其它 9 种类固醇的校准范围为 0.0025 -50 ng/mL。血清基质曲线仅用于空白血清中未达到检测浓度的分析物（表 2）。

LC 方法：Agilent 1290 Infinity UHPLC 系列二元泵、多孔板自动进样器、柱温箱色谱柱：Extend C18，2.1x50mm 1.8 um，600 bar柱温：50 ºC进样体积：2 µL自动进样器温度：4 ºC进样针冲洗：冲洗端口（甲醇 : 水 75:25），10 s流动相：A = 0.02% 氢氧化铵水溶液B = 甲醇 : 异丙醇 75:25流速：0.4 mL/min梯度程序：7 min 内从 20% B 到 47% B，再于 1 min 内升至 95% B，保持 0.5 min，后运行时间 1.5 min。每次运行的总时间为 10 min。MS 方法：配备离子漏斗技术的 Agilent 6490 三重四极杆质谱离子模式： 安捷伦喷射流正离子/负离子干燥气温度： 200 ºC干燥气（氮气）流量： 15 L/min雾化气压力（氮气）： 35 psi鞘气（氮气）温度： 250 ºC鞘气流量： 11 L/min毛细管电压： +4000V/-3000V喷嘴电压： +0V/-2000VQ1/Q2 分辨率： 1.2/0.7 单位切换驻留时间： 40 msDelta EMV: +100V/-100V

结论• 8.5 min 内，13 种类固醇中除了雌二醇均实现了基线分离。当然，雌二醇并非 Androsteronedione 或雌酮的同重化合物，所以不影响其定量计算• 校准曲线具有良好的线性 (> 0.995)，动态范围超过三个数量级• 13 种类固醇的 LC-MS/MS (QQQ) 分析实现了良好的准确度、精密度、重现性和信号稳定性• 该快速简便的 LC-MS/MS 方法适用于在单次运行中分析生物基质内的一些内源性类固醇