尿液中香草苦杏仁酸、高香草酸LC/MS/MS 分析法

摘要：本研究中开发出了一种用于尿液中香草苦杏仁酸 (VMA)、高香草酸 (HVA) 和 5-羟基吲哚 乙酸 (5-HIAA) 定量分析的高灵敏度、高特异性 LC/MS/MS 方法。这一分析方法采用简 单稀释作为样品前处理过程即可达到所需功能灵敏度，同时还能够对相当宽动态范围内 的分析物进行定量分析。所有化合物均表现出良好的重现性 (CV < 6%)，此外所有校准曲 线都具有线性 (R2 > 0.9998)。

前言：液相色谱/三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于多种分析物的快速分析。本研究开 发出了一种用于尿液中 VMA、HVA 和 5-HIAA（图 1）同时测定的简单样品前处理稀释流程。 将不同浓度的每种分析物加标至洁净尿液中制得校准物。色谱系统中包括五氟苯基 (PFP) 色 谱柱以及甲醇与含 0.2% 甲酸的水组成的流动相。研究中对定量和定性 MRM 离子对进行监 测，并加入了每种分析物的氘代内标以确保定量分析的准确性与重现性。

实验部分 液相色谱方法 液相色谱系统由 Agilent 1290 Infinity LC 二 元泵、配备恒温箱的孔板进样器以及柱温箱 组成。如果使用的液相色谱系统具有不同的 延迟体积，则可能需要调节并验证梯度以使 色谱分析结果具有可重现性。

质谱方法 Agilent MS/MS 系统由采用安捷伦喷射流 技术的 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 和 Agilent MassHunter 软件 B.06.00 组成。 化学品与试剂 校准物和内标均购自 Cerilliant (Round Rock, TX)。DC Mass Spect Gold 尿液 MSG5000 购自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。Lyphocheck 376 和 377 对照品购自 Bio-Rad 以及 Burdick & Jackson。LC/MS 级甲醇购自 VWR。质谱分析用甲酸购自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO)。 样品前处理 通过将每种分析物加标至 DC Mass Spect Gold 尿液中制得标准校准物。通过连续稀 释 DC Mass Spect Gold 尿液来获得其余 标准校准物浓度。使用含内标的 0.2% 甲 酸水溶液将校准物、对照品和尿样稀释十 倍。样品应经过离心和/或过滤后再进样至 LC/MS/MS 系统中。 数据分析 Agilent MassHunter 定量分析软件 (B.06.00) 用于进行数据分析。在校准曲线的线性回归 中采用 1/x 作为加权因子。在 MassHunter 定量软件中，利用色谱峰面积与已知浓度内 标的峰面积之比进行定量。

结果与讨论：采用安捷伦五氟苯基 (PFP) 色谱柱实现了所有分析物的色谱分离（图 2）。对尿液中存 在的 HVA 与 5-HIAA 干扰进行分离显得尤 为重要。如果不根据保留时间进行适当分离， 这些化合物将相互干扰，导致不准确的定量 结果。 为研究基质效应，将 10 种不同浓度的所有 分析物加标至含 0.2% 甲酸的水中。另一组 样品将分析物加入空白尿液中，制备方法与 上述相同。研究中利用内标溶液对所有混合 物进行稀释后对其进行分析。随后根据计算 得知，两种溶液中每种分析物的峰面积比均 介于 91% - 93% 之间（表 2）。而使用内标 峰面积比校正计算浓度时，则得到了出色校 正结果，结果介于 93% - 115% 之间（表 2）。 这一结果确认了内标对偏差进行了校正。 分别于连续三天以及一天中三次制备校准标 样和 Bio-Rad Lyphocheck 对照品，以便确 定日内和日间的精密度和准确度。三种分 析物的日内和日间准确度均在 10% 内，且 线性范围内所有浓度的变异系数均小于 6% （表 3 和表 4）。该分析方法在浓度为 0.078 - 100 mg/L 的测定范围内具有出色的线性， R2 值均大于 0.9998（图 3）。

结论 本研究开发了一种用于定量尿液中香草苦杏 仁酸 (VMA)、高香草酸 (HVA) 和 5-羟基吲哚 乙酸 (5-HIAA) 的分析方法。该方法通过简单 的稀释步骤实现了全部三种分析物的同时测 定，具有出色的回收率、重现性和准确性。