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液质联用在蛋白质药物糖基化分析中的应用

2019年08月12日 09:17 来源:赛默飞色谱及质谱

糖基化对蛋白药物的疗效,稳定性,免疫 原性具有重要点影响。以单克隆抗体为例, 常见的N-糖型主要为G0F、G1F、G2F、G1FGlcNAc、G0F-GlcNAc等;如果出现OligoMan、 Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型, 则会影响免疫原性或半衰期,需要避免;另 一方面,可以细胞工程及分子生物学技术, 提高A-Fuc,GlcNAc bisecting,G2F, Hyper Sialyation(NANA)的含量,以增强ADCC,CDC, Anti-inflammatory 等效能。寡糖为非模板合成, 并呈树状结构,其结构极其复杂,仅由6种单 糖组成的寡糖链,其理论结构即达到惊人的 1012种。这就要求用于寡糖的分析设备具有强 悍的分析性能。Thermo Fisher开发了一系列简单、的液相色谱-质谱表征方法,涵盖 了从糖链结构分析、到糖基化位点鉴定、再 到糖肽解析的完整分析流程(图2)。

 

一、寡糖链分析 N-糖链(由天冬酰胺连接寡糖)结构分析 包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数 据处理四个步骤(图2)[1] 。寡糖链释放根据 不同的糖基化类型选择不同的方法,N-糖链主 要使用PNGase F。衍生化标记步骤可以增强寡 糖的质谱响应。其中,还原末端标记2-AB等苯 胺或杂环化合物还可使寡糖链通过荧光检测, 全甲基化标记增强寡糖链的疏水性,实现反 相分离检测。以Q-Exactive为代表的Orbitrap超

高分辨质谱具有高的灵敏度优势,使用其直 接分析未标记的糖链也可以取得满意的效果。 寡糖碎片质谱可使用SimGlycanTM软件进行全 自动结构解析,获得寡糖链精细结构信息。在寡糖色谱分析中,专门为寡糖分离设计 的GlycanPac AXH-1/AXR-1色谱柱,结合了弱阴 离子交换WAX和亲水相互作用HILIC (AXH-1)/反 相RP (AXR-1)两种保留机理,能够率地分 析复杂寡糖链混合样本。经典的HILIC/RP机理 可以根据电荷数、极性、大小实现寡糖链分 离,而WAX机理保留和选择带负电荷的寡糖 链,对含唾液酸的寡糖链具有很好的分离效 果。使用GlycanPac色谱柱分析2-AB标记的牛 胎球蛋白(Bovine Fetuin) N-糖链,结果表明寡 糖链得到有效分离,特别是对含有唾液酸的寡糖的分离效果良好(图3A)。即使分析未 标记的天然牛胎球蛋白N-糖链(图3B),仍 然获得了理想的分离效果[2,3] 。

以 Q-Exactive 为代表的静电场轨道阱 Orbitrap具有10万以上的超高分辨率和amol级 的超高灵敏度,结合高能碎裂(HCD)模式,能 获得丰富的碎片信息,并分辨和检测寡 糖。通过牛胎球蛋白三天线复杂型N-糖链的二 级质谱分析(图4A)可以看出,即使是寡糖链没有被标记,谱图仍然获得了丰富的高强 度碎片信号,特别是B/Y、C/Z等跨环断裂信息, 对寡糖链精细结构的解析具有重要作用。实 验在牛胎球蛋白中成功解析了29种不同结构 的N-糖链(图4B),其中绝大部分为含唾液 酸的寡糖链,证明UHPLC-Orbitrap对复杂寡糖 链的强大分析能力 [4] 。 GlycanPac 色谱与 Orbitrap结合还实现了仅糖苷键/构象不同的同

专业糖链结构解析软件SimGlycanTM可实现 对复杂寡糖链谱图的全自动解析。将实验获 得的寡糖链数据与内置数据库中寡糖链的理 论碎片谱图匹配,分别获得糖苷键断裂、双 糖苷键断裂、跨环断裂、跨环断裂+糖苷键断 裂的匹配率(图6),进而计算得到寡糖链的 结构解析结果[6] 。此外,还可以利用线性离子阱质量分析器 的多级功能(MSn),对同分异构寡糖链进行多级碎裂和检测,获得单糖构象、糖苷键连接 等精细结构的更多差异信息,从多角度实现 同分异构寡糖链的结构解析和分辨[7] 。

 

二、糖基化位点分析 N-糖基化位点鉴定通常使用PNGase F 酶释 放糖链,使肽段上产生去糖基化位点,并在 肽段上产生去糖基化痕迹:天冬酰胺(N)发生 脱氨基化,造成0.9840 Da的质量增加。通过 质谱寻找发生+0.9840 Da的天冬酰胺,以及N- 糖基化保守序列NXS/T (X代表脯氨酸以外的任 何氨基酸)过滤,获得可信的鉴定结果(图8)。 为了避免天然脱氨基化造成的假阳性,可以在18O水中进行酶切,使去糖基化位点含有一 个18O,形成+2.9890Da,可与天然脱氨基区分。

 

糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨 率与灵敏度具有较高要求。Orbitrap由于具有 超高分辨率和超高灵敏度,无论对于单抗等 纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品, 都是是糖基化位点表征的工具。目前糖 基化位点大的数据集,共从小鼠组织与血 浆中注释了6367个糖基化位点[8] 。该实验采用 用PNGase F 释放糖链并标记18O方法,使用 Orbitrap鉴定糖基化位点,共鉴定到6367个位点,其中5753个位点是没有记载的新位点。 该研究对糖蛋白的研究具有重要意义(图9), 也展示出了Orbitrap超群的性能。在相对简单 的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中, Orbitrap更可毫无疑问地胜任此工作[9] 。

 

三、糖肽分析 糖肽分析前处理简单,能同时鉴定糖基化 位点和解析寡糖链结构,并获得位点特异性 糖链信息,即微观不均一性。但是糖肽解析 比糖链与糖肽分开解析的传统方法更为复杂: 寡糖链离子化效率较低;相比肽段骨架更易 碎裂,造成肽段骨架难以充分碎裂;谱图非 常复杂,传统搜库手段。HCD高能碎 裂相比传统CID能获得更丰富的碎片信息,使 糖肽的寡糖链和肽段骨架充分碎裂。Orbitrap

超高分辨质量分析器能有效分辨糖肽产生的 复杂碎片,避免碎片离子间的相互干扰,提 高离子化效率较低的寡糖碎片响应。ByonicTM 可以实现复杂糖肽谱图的全自动数据处理, 解析肽段骨架序列和寡糖链结构。

 

单抗药物利妥昔(Rituximab)经Trypsin酶切 后,使用Q-Exactive在线分析,碎裂模式为 HCD,并使用ByonicTM解析谱图。图10展示了 糖肽EEQYNSTYR的谱图解析结果,谱图中存在 着丰富的糖肽碎片离子,并获得超高质量精 度的可靠匹配,确定糖链结构为G0F。特别是 低分子量端的单糖和寡糖碎片,能够作为诊 断离子,进一步确证糖肽解析结果[10,11] 。

融合蛋白药物通常为糖蛋白,其糖基化 比单抗更为复杂。单抗寡糖链结构已研究的 较为透彻,但融合蛋白存在诸多未知寡糖链,这类糖肽的解析普通液质难以胜任。Orbitrap 超高分辨率、超高质量精度和灵敏度为未知 糖肽解析提供了有效解决方案。实验使用 Orbitrap对高度糖基化的一种Fc融合蛋白药物 进行了完整糖肽解析。该融合蛋白同时含有 多个N-糖和O-糖位点,寡糖链结构未知。以糖 肽TKPREEQYNSTYR解析结果为例(图11), HCD谱图同时获得了丰富的寡糖链碎片和肽段 骨架碎片,使用ByonicTM得到可靠鉴定结果 (图11A)。由于寡糖链存在诸多同分异构体, 因此实验进一步使用了SimGlycanTM确证寡糖 链结构,该寡糖链结构确证为三链高甘露糖 型 ( 图 11B ) 。 解析结果汇总表明 , 仅 TKPREEQYNSTYR上N317一个位点,就有15种 结构各异的寡糖链(图11C)。实验共获得2 个N-糖基化位点、16个O-糖基化位点,83种 位点特异的寡糖链结构,为该融合蛋白的研 究和申报提供了重要表征信息[12] 。

 

Orbitrap质量分析器与HCD高能碎裂能有 效应对复杂未知糖肽解析的挑战。对于一些 仍无法解析的情况,还可以利用多级裂 解MSn获得寡糖链精细结构,或通过电子传递 裂解ETD得到更多肽段骨架碎裂,获得与HCD 互补的结构信息[12-16] 。

 

四、ETD与O-Linked糖肽分析 O-Linked糖基化,主要发生在丝氨酸(S) 与苏氨酸(T)残基。在对O-Linked糖基化进 行位点分析时,会遇到较N-Linked糖基化更大 的困难。一方面,O-Linked糖基化分析中,缺 乏像N-Linked糖基化分析里使用的PNGases F糖

苷酶,而难以进行去糖基化位点质量标记。 另一方面。在多肽序列中,S与T经常密集出现, 如果使用常规的碰撞诱导解离(CID)方法, 糖苷键将成为主要的断裂碎片,因此难于获 得丰富的肽段碎片信息,导致序列及O-Linked 糖基化位点分析困难。因此O-Linked糖基化分 析需要使用到ETD(电子传递解离)技术。ETD优先断裂肽段骨架,避免了寡糖链的碎裂, 能为O-糖肽提供有效信息。通过ETD分析人血 清富组氨酸糖蛋白(HRG)T271-284肽段的两 种不同寡糖链结构的O-糖肽,获得了丰富的 肽段骨架碎片信息(c/z系列离子),而寡糖 链得以有效保留,降低了谱图复杂性,有利 于糖基化位点与结构解析(图12)[17] 。

 

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