质谱在蛋白质药物二硫键分析中的应用

二硫键对于稳定蛋白质药物的空间结构， 保持其活性具有重大的作用。而在蛋白质药 物的生产过程中，由于成本控制的需求，往 往追求较大的蛋白质表达浓度，而使发生二 硫键错配(disulfide scramble)的可能性有所上 升[1] 。因此，二硫键的连接确证成为蛋白质药 物质量表征的必须环节。相对于对角线电泳 法、突变分析法、部分还原测序法，以及X晶 体衍射和核磁共振等技术，串联质谱在灵敏 度、准确性、操作性等多方面*优势，已 经成为二硫键表征的主流方法[2] 。早期的二硫 键液质分析，采用人工对比还原与非还原肽 图数据策略（图1），来确定二硫键。这种策 略的灵敏度差、分析通量低、不同分析人员 造成的分析结果差异较大。近年随着质谱及 软件技术的迅猛发展，目前二硫键分析工作， 已经进入了直接分析阶段，也就是直接采集 非还原蛋白质药物肽图串联质谱数据，并通 过化软件自动化查找二硫键。

在二硫键的质谱分析中，碰撞诱导解离 （CID）与高能碰撞解离（HCD）是普遍的二级碎裂方法。使用HCD/CID作为采集二硫键 数据的优点主要有：碎片信号较丰富，且强 度较均匀，采集频率快，以及仪器价格经济。 图2为链间、链内以及复合型二硫键连接肽段 的二级碎片图谱示例[3] 。

蛋白质药物二硫键分析主要有两种需求， 分别是1）对期望二硫键连接的验证；2）对 未知（错配）二硫键的发现。在针对种 需求进行分析时，一般会将预期的二硫键连 接方式输入软件。分析软件仅是在提供的连 接方式中寻找是否有匹配的质谱信号。第二 种需求则是在仅提供蛋白氨基酸序列的情况 下，对未知（错配）二硫键进行发现鉴定。 由于蛋白质中存在众多的半胱氨酸，而任意 两个半胱氨酸都存在形成二硫键的可能性， 加之考虑到可能存在的非特异性酶切以及可 变修饰等因素，致使各种连接可能性的数目 以组合爆炸的规模出现。面对这种严酷的分 析要求，软件需具有*大的数据处理性能。

软件已经成为二硫键分析的关键一环。其中专门针对Orbitrap系列质谱碎裂特点所设计 的软件种类多，如pLinks[3,4] 、StavroX[5] 等， 这也从一个侧面说明了Orbitrap型质谱在二硫 键分析中已被为广泛地应用。在这些软件 中，较为出色的如pLinks具有了令人振奋的数 据分析性能。在进行错配二硫键发现时， pLinks可在考虑肽段N、C两端都为非特异性酶 切，并含可变修饰条件下，在几分钟内就可 完成二硫键数据检索。Thermo 新近推出的 PepFinder作为整合的生物制药软件分析平台， 同样具备了未知二硫键检索功能，为分析人 员的工作提供了极大的便利。

需要指出的是，二硫键分析实验由于需要 在不*对蛋白质进行变性（不还原二硫键） 的情况下进行，酶切相对普通肽图分析（蛋 白质被充分变性后酶切），较难一次得到理 想的酶切效果，因此在样品处理方面，需要 根据不同的样品，摸索和优化样品处理方法。 考虑的因素包括：酶切的时间、多酶酶切选 择[6] ，减少碱性环境、封闭自由半胱氨酸以避 免引入错配二硫键等等 [3,7] 。这些都是在实验 设计及结果分析中需要特别注意的方面。

此外，二硫键分析还具有一般肽图分析不 具有的复杂性，如：链内二硫键[8] 、多对以上 二硫键结构 （ 如 cystine Knot and nested disulfide）[6] 、糖肽形与二硫键同时存在[9] 、通 过二硫键形成的环肽[10] 等。在这些情况下， 单纯使用一种碎裂方法所获得的信息有限， 因此ETD与MSn等质谱技术就成为了CID/HCD技 术的有效补充。

ETD技术作为与CID/HCD并列的多肽碎裂 技术，其碎片特性与后两者有着明显的不同。 在二硫键碎裂方面，明显的差异就是， CID/HCD无法打开二硫键，以及含链内二硫肽 段在两个半胱氨酸之间的序列区域无法产生碎片。而ETD在这两种情况下都可以产生碎片 [11] 。如图X。显而易见，ETD与CID/HCD产生的 碎片信息互补性*，综合使用将非常有利 于终得到可信的结果[7] 。

多级质谱也是针对复杂二硫键分析时可以 选择的一种方法。Wu等使用ETD对含二硫键 肽段进行二级碎裂后，根据其碎片特点进行 CID-MS3碎片采集（图4），得到了更丰富的碎 片信息，这种方法已经广泛应用于多种蛋白 质药物产品的分析中[7，12] 。

在ETD与MSn联用的方法中，对于一级质 谱中发现的母离子，平行进行CID与ETD二级 信息采集。通过两种碎裂方式产生碎片互补 性，可得到更为充分的序列信息。此外，对于链间二硫键，由于ETD自身特点，在ETD的 二级碎片中，常常会出现两种强信号。 种强信号是由单纯的二硫键断裂（两条肽段 分离，但都各自保持完整，表示为Pep1和 Pep2）产生的。在这种情况下，可以分别针 对Pep1和Pep2采集三级CID碎片。这样就可以 分别得到两个肽段各自清晰的碎片信息。显 而易见，相对于两种肽段混在一起的MS2碎片， MS3碎片信息更具针对性，从而大大提高了其 鉴定可信度，与碎片覆盖度。二级ETD经常产 生的另一种强信号，表面上看是一级母离子 减少电荷的形式。而其中实际包含了1）已发 生碎裂，但Pep1与Pep2仍通过非共价键粘附 在一起的形式，以及2)真正的单纯减少电荷离 子形式。对于后者，可以通过增加活化能以 及MS3、MS4等方法，进一步挖掘序列信息。

串联质谱技术，已经成为蛋白质药物二硫 键分析重要的手段。在Orbitrap及离子阱质 谱高质量的数据条件下，加之软件技术的巨大发展，使得二硫键检索分析实现了快速、 准确、高通量的要求，从而使二硫键分析进 入了常规化分析时代。

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