整体水平蛋白质药物的质谱表征

整体分子量测定是蛋白质药物产品（如单 抗）研发与质控中常进行的分析项目，而 ESI-Orbitrap MS（电喷雾离子化-静电场轨道阱 质谱）已经成为常用的测量方法之一。而 另一种常见质谱技术MALDI—TOF（基质辅助 激光解析-飞行时间质谱）无法进行此项分析， 其原因是由于：在MALDI条件下，蛋白将主要 形成单电荷离子，而目前的TOF型质谱 在高质荷比范围分析中（10万m/z以上范围）， 分辨率也仅有数千。因此当面对质量巨大的 蛋白质药物离子时（如单抗分子量近15万）， TOF分辨率明显不足，不但无法进行分子量的 测定，甚至连单抗的糖型也根本无法辨 别（图1）。在ESI（电喷雾离子化）条件下， 蛋白分子将携带多电荷，以单抗为例，其将 携带40-70 个左右的电荷，信号落入2500- 3500m/z 范围内 。 在此质荷比区域内 ， Orbitrap质谱仪分辨率可达几万，因此可从容进行此 项分析。

实验时，蛋白首先在液相色谱 中通过C4反相色谱柱进行脱盐，然后在电喷雾离子源实现蛋白离子化，离子化的蛋白进 入质谱，产生原始质谱数据，数据将通过去 卷积软件计算出蛋白质的质量。与TOF原理完 全不同，Orbitrap采用傅里叶变换进行离子质 量分析，在低质荷比区域，其分辨率可达40 万以上，而TOF分辨率仅为数千。在2000- 4000m/z范围，两者分辨率近似，但由于原理 的不同，Orbitrap更易于实现基线分离——也 就是说即使在分辨率一致的情况下，相比TOF， Orbitrap可获得更为清晰的质谱原始数据（图2） [1-3] 。高质量的原始数据为分析结果提供了保 证。在完整单抗分析中，Orbitrap准确度一般 为10ppm内（以单抗分子量15万计算，10ppm 约相当于1.5Da），而TOF为20-30ppm左右。 Orbitrap不仅准确度高，更由于在硬件中伴有 离子蓄积设计，而使灵敏度更高（TOF质谱受 到分析原理的局限，不能大量蓄积离子分析， 在一定程度上影响了其灵敏度）。在图3中， Orbitrap数据清晰地显示出单抗9种不同的糖型 组合，主要峰的质量误差在10ppm之内。

图1：单抗全分子量原始质谱图对比，左为MALDI-TOF，右为ESI-Orbitrap数据。其中在对高质 荷比离子进行采集时，由于灵敏度原因，TOF只能采用离子的线性飞行模式（此模式下分辨率 仅为数千），而无法采用分辨率更高的反射飞行模式（分辨率可达5万）。

在单抗类药物中，抗体-化学药物偶联物 （ Antibody-Drug Conjugate, ADC）利用抗体对 靶细胞的特异性结合能力，输送高细胞毒性 化学药物，来实现对癌变细胞的有效杀伤。 目前，经FDA已批准上市的ADC药物有三种， 分别为MylotargTM、AdcetrisTM，KadcylaTM，分 别治疗急性髓系白血病，霍奇金淋巴瘤，以 及HER2阳性的转移性乳腺癌。全分子量测量 技术也可用于 ADC 药物的 DAR （ Drug to Antibody Ratio）值分析。图4为某ADC药物去 糖基化后，Orbitrap分析结果，其中偶联了不 同数量化学药物的质谱信号清晰明确，有利 于准确计算DAR值（图4中，未标示的峰为 Free Linker信号）。

在Orbitrap平台上还具有一项*的分析 方法——Top Down（至上而下）技术。Top Down是在完整蛋白的状态下，直接对蛋白整 体进行碎裂，通过碎片分析获得蛋白结构信息（图5）。在蛋白药物分析中，可用于电荷 异质性分析的快速方法开发，以及肽图序列 信息验证。

木瓜蛋白酶及还原快速处理后的，分子量约 为2.5万Da的重链Fab与轻链Fab部分进行分子 质量测量时，原始质谱数据可实现同位素分 辨，因而可进行同位素质量计算（在全单抗 分子下，目前各种类型质谱数据仅可做平均 分子量测算）。同位素质量精度较平均分子 量更为。在图6中，单抗重链Fab与轻链 Fab的分析准确度分别达到了惊人的2.7ppm与 0.9ppm（以Da计算，质量误差约在小数点后 第二位）。如前所述，加之Top Down提供的 丰富的碎片信息，此项技术被用于可用于电 荷异质性分析的快速方法开发，以及肽图序 列信息快速验证工作[3] 。

基于Orbitrap的全分子量分析工作，可在 数分钟内完成。但事实上，这项看似简单的 分析工作，却蕴含了对质谱准确性、分辨率、 灵敏度、稳定性的多项挑战，却也正好是 Orbitrap强大性能的集中体现。Orbitrap系列质谱也正是基于这样的品质，为其使用者提供 了有力的技术保证。