安捷伦LC/MS/MS对婴儿配方奶进行黄qu霉毒素分析

黄qu霉毒素 M1 是牛奶中主要的一种黄qu霉毒素。欧盟委员会 (EC) 规定欧洲婴儿配 方奶中该物质的大浓度为 0.025 µg/kg。在美国，食品和药品监督管理局 (FDA) 规定 牛奶中黄qu霉毒素的干预浓度为 0.5 µg/kg。本应用简报介绍了采用 Agilent Bond Elut 增强型脂质去除产品 EMR-Lipid 通过 LC/MS/MS 对婴儿配方奶中的黄qu霉毒素 M1、G2、 G1、B2 和 B1 进行测定。本研究首先采用 QuEChERS 萃取，然后采用 EMR-Lipid 分散 式固相萃取 (dSPE) 进行净化。该方法可使所有浓度的所有黄qu霉毒素实现出色的回收 率 (88%-113%) 与精密度 (RSD = 1.3%-13.6%)。由于充分的基质去除，其定量限 (LOQ) 要远远低于美国和欧洲的法规限值。这一简单而稳定的方法仅需极少设备和专业技术， 因此可在食品实验室中实现轻松应用

真菌毒素是真菌的次生代谢产物，是食品和饲料供应中常 见的污染物之一。粮食及农业组织 (FAO) 估计世界上有多 达 25% 的农产品受到了真菌毒素的污染。这种污染会造成灾难 性的经济损失，对粮食产业而言更是如此 [1]。黄qu霉毒素（表 1） 是由多种真菌（特别是黄qu霉和寄生曲霉）产生的一类真菌毒 素 [2]。黄qu霉毒素 M1 是牛奶中常见的真菌毒素，奶牛食用 了受黄qu霉毒素 B1 污染的饲料并对其进行代谢后即可产生黄qu霉毒素 M1 [3]。美国食品和药品监督管理局 (FDA) 以及欧盟委 员会 (EC) 均已对多种食品中的黄qu霉毒素限值进行了规定 [4,5]。 表 2 总结了美国和欧洲的 FDA 和 EC 黄qu霉毒素限值。

黄qu霉毒素的法规限值极低，在婴儿食用的乳制品基质和配方奶 中更是如此。为去除基质干扰以增强低浓度下的分析物信号，样 品前处理*。通常使用免疫亲和柱分析多种包括黄qu霉毒 素在内的真菌毒素 [6-9]。但这类色谱柱价格昂贵，并需要采用 对食品实验室来说并不方便的*的多种工作流程。快速、简便、 经济、、耐用和安全的 QuEChERS 方法针对样品采用简单的 三步流程（萃取、净化和分析）。因此，该方法在谷物和乳制品 中包括黄qu霉毒素在内的多种不同分析物和基质的前处理方面极 具前景 [3,10,11]。但通过 C18 或 PSA 进行的 QuEChERS 净化 在分析肉类和牛奶等含有大量脂质的样品时有一定限制。这种限 制来自于与目标分析物的非选择性相互作用以及几乎无法去除的 主要脂类物质。所有残留的脂质均会聚集于分析流路中，从而导 致维护次数增加、色谱图异常，并大大降低数据准确度和精密度。

Agilent Bond Elut 增强型脂质去除产品 EMR-Lipid 是一种新型 吸附剂，该产品结合了*的体积排阻和疏水相互作用，可选择 性去除样品中的主要脂类，且不会保留不需要的其他分析物。这 种吸附剂可用于通过 QuEChERS 进行的 dSPE 净化以及蛋白质 沉淀工作流程，有助于实现简单的净化 [12,13]。本研究对 婴儿配方奶中的五种黄qu霉毒素进行了分析。婴儿配方奶富含脂 质且有明确的黄qu霉毒素法规限值，因此选择它作为基质。在 QuEChERS 萃取后进行 EMR-Lipid dSPE 净化，并使用无水 MgSO4 进行增强的样品（净化）后处理（步骤），可获得出色的 基质去除效果。本应用简报证实了 EMR-Lipid 在三种不同浓度的 黄qu霉毒素分析中的有效性。

实验部分 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。乙腈 (ACN) 和甲醇购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。水的净化处理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 完成。试剂级甲酸 （FA，部件号 G2453-85060）来自安捷伦科技公司。欧洲标准 物质 ERM-BD283（含低浓度黄qu霉毒素 M1 的全脂奶粉）购自 LGC Standards (Teddington, Middlesex, UK)。黄qu霉毒素 M1 （10 µg/mL，溶于乙腈）、黄qu霉毒素混合物（B1、G1、B2、 G2：均为 20 µg/mL，溶于乙腈）以及甲酸铵购自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO, USA)。根据生厂商的建议，黄qu霉毒素标 准储备溶液分别在 2-8 °C (M1) 以及 -20 °C（B1、B2、G1、G2 混合物）下储存。液态即食婴儿配方奶购自当地杂货店。

设备 所用的仪器与材料： • Eppendorf 移液器和连续分液器 • 涡旋仪和多管涡旋仪 (VWR, Radnor, PA, USA) • Geno/Grinder (SPEX, Metuchen, NJ, USA) • Centra CL3R 离心机 (Thermo IEC, MA, USA) • Turbovap LV (Biotage, Charlotte, NC, USA) • Eppendorf 微量离心机 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY, USA) • Agilent Bond Elut 早期 QuEChERS 方法（无缓冲盐）萃取试 剂盒（10 g 样品），配有陶瓷均质子（部件号 5982-5550CH） • Agilent Bond Elut EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管 （部件号 5982-1010） • Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish MgSO4 反萃管（部件号 5982-0102）

仪器 采用 Agilent 1290 Infinity LC 进行分析，其中包括： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • 配备 Agilent 1290 FC/ALS 温控装置 (G1330B) 的 Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 该液相色谱系统联用配备安捷伦喷射流电喷雾离子化技术的 Agilent 6460A 三重四极杆 LC/MS/MS 液质联用系统。采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行所有的数据采集和分析。

样品前处理 取液态婴儿配方奶 (10 mL) 加入 50 mL 离心管中，并添加适量 标准品作为质量控制 (QC) 样品。加入两粒陶瓷均质子及 10 mL 乙腈，然后将样品涡旋混合 2 分钟。在样品中加入早期（非缓冲 盐，10 g 样品）QuEChERS 萃取盐包。在机械振荡器中将样品混合 2 分钟，然后在 5000 rpm 下离心 5 分钟。在 EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管中加入 5 mL 水，然后加入 5 mL 样品粗 提物。立即对样品进行涡旋混合，然后用多管涡旋仪继续涡旋混 合 60 秒。将样品在 5000 rpm 下离心 5 分钟，然后将其倒入另一 个空的 15 mL 离心管中。将 Polish 除脂萃取盐包中的无水硫酸 镁 (MgSO4) 加入萃取液中。立即将样品涡旋混合 60 秒以分散其 中的盐，然后以 5000 rpm 离心 3 分钟。将上清液移至含有 1.5 g MgSO4（来自新的 Polish 除脂萃取盐包）的 15 mL 离心管中。立 即对样品进行涡旋混合，然后再次涡旋混合 60 秒。以 5000 rpm 离心 3 分钟后，将终样品 (1 mL) 转移至一个 16 × 100 mm 的 玻璃试管中，并在 50 °C 下用氮气吹干。吹干前需要向空白基质 中加入校准标样。用 100 µL 含有 0.1% 甲酸/乙腈 (80/20) 的水 对样品进行复溶，并涡旋混合至少 2 分钟。然后对样品进行超声 处理与离心（如需要）。将终样品转移至带内衬管的样品瓶中 进行 LC/MS/MS 分析。图 1 展示了整个样品前处理过程。

校准标样和质量控制 将储备液用乙腈稀释制得黄qu霉毒素工作溶液，浓度分别为 2 µg/mL（黄qu霉毒素 M1）和 10 µg/mL（黄qu霉毒素 G2、G1、 B2 和 B1）。为满足不同的法规限值要求，黄qu霉毒素 M1 的浓 度比其他黄qu霉毒素的浓度低 5 倍。通过对工作溶液进行适当稀 释而制得 100x 终浓度的校准品和 QC 标准品。表 4 列出了婴 儿配方奶中校准品和 QC 样品的终浓度。将工作溶液、所有校 准品及所有 QC 标准品均置于棕色瓶于 2-8 °C 下储存。在萃取前， 向基质空白婴儿配方奶中加入 100 µL 的相应 QC 标准品。而对 于基质匹配校准标样，在吹干前向 990 µL 的基质空白乙腈萃取液 中加入 10 µL 适当校准标样。

结果与讨论 方法优化 EMR-Lipid 可用于蛋白质沉淀和 QuEChERS 工作流程中。初步 测试表明，蛋白质沉淀和 QuEChERS 流程均适用于液态婴儿配方 奶中的黄qu霉毒素分析。而由于传统蛋白质沉淀过程中的稀释因 子较大，故在本应用中选择 QuEChERS 方法。在进行了预实验后， 对本应用选择了早期 QuEChERS 萃取盐，但 AOAC 与 EN 萃取 盐均适用。根据信噪比 (S/N) 标准得知，为达到黄qu霉毒素 M1 的预期定量 限 (LOQ)，需要对样品采用浓缩步骤。分别对 5x、10x 和 20x 浓 度进行评估后发现，在给定的仪器设置下，10x 浓度可满足 LOQ 和方法的需求。图 2 展示了在经过 QuEChERS 萃取、EMR-Lipid 净化以及采用 MgSO4 的增强的样品（净化）后处理（步骤），婴 儿配方奶中黄qu霉毒素的 LC/MS/MS dMRM 色谱图。