蛋白质药物肽图分析简介

在蛋白质药物产品的质控要求中，需要对 蛋白氨基酸序列进行确证，对相关修饰进行 鉴定以及定量——即肽图分析。肽图的液质实 验流程主要包括：蛋白的变性、二硫键的还 原与烷基化、以及蛋白酶酶解（通常使用胰 蛋白酶 Trypsin）、液质联用数据采集、数据 处理几个步骤（图1）。在这个流程中， Orbitrap 型质谱以其超高分辨、高质量精度、 高灵敏、高稳定性成为业内推崇的质谱分析 平台。除此之外，考虑到生物制药应用的特 殊需求 ， 根据蛋白药物质谱分析特点 ， Thermo Fisher与世界制药企业Amgen联 合开发了 PepFinderTM 软 件 。 实际上 ， PepFinder来源于Amgen内部的自制的肽图分 析软件，因此其功能设计从一开始就听从了 一线分析人员的切实需求 [1,2] ， 而 Thermo Fisher的加入，则使软件底层对质谱数据处理 的性能大大提高。因此，PepFinder一经公开 发布，就受到了业内的极大关注与好评。

除基本的肽段序列确认、覆盖率分析、 修饰位点鉴定与定量、错配二硫键发现、图 谱对比、CID/HCD/ETD碎片解析等功能外， PepFinder还*未知修饰发现、氨基酸突变 查找功能[1-5] 。这两项功能可以帮助大家快速 发现序列变异，避免可能出现的巨大的质量 风险。不仅如此，PepFinder还有更多贴心的 功能设计，如内置了CHO细胞系糖型，并可一 键选择进入糖肽分析流程；再如，除具有肽 段鉴定可信度评价功能外，还可智能显示多 肽的理论质谱碎片，并用于与实验图谱直观 对比，以辅助分析，并可快速提高分析员质 谱解析水平。这些功能不但减少工作强度， 也降低了对分析员理解质谱数据深度的要求[6- 11] 。更具情怀的是，对于氨基酸固定修饰设置， 不同于其它类似软件（固定修饰只可至 某一类氨基酸），在PepFinder中，可以 到特定的某个氨基酸位点。此功能对于蛋白 药的某些特殊分析需求提供了极大的便利。

图2为PepFinder的氨基酸序列鉴定覆盖率 结果显示图 。 相较于其它类似软件 ， PepFinder的覆盖率显示方法更适用于蛋白药 物肽图分析，其中不仅包括了结果总结与具 体的鉴定情况，还含有鉴定序列的色谱保留 时间与强度信息。这些便捷的信息显示为某 些情况下的肽图方法开发，指出了优化方向。修饰的鉴定与定量也是肽图分析中的必须 项目。Orbitrap具有的灵敏度与准确性， 配合PepFinder软件，使此项分析工作不再繁 重。图3中，为一蛋白药物某肽段中色氨酸残 基(W)的正常形式与双氧化形式的二级鉴定图 谱。其中双氧化形式肽段丰度仅为总量的 0.13%，但仍得到了高质量的碎片与定量信息。

图4为另一常见的多肽修饰——脱氨基 (deamidation)。在此例中，同一个肽段内含有 两个天冬酰胺(N)，通过液质分析，不但实现 了对脱酰胺化肽段的鉴定与定量，而且对于 不同位置的脱酰胺化，Orbitrap都采集到了高 质量的二级碎片信息，使之得以分辨。

图5显示了针对蛋白质药物分析的一些特 殊参数设置，如二硫键检索、CHO细胞系糖肽 检索、未知修饰发现、氨基酸突变鉴定等功 能。这些功能有助于提高分析人员的工作效 率，降低数据分析难度，更可以帮助及时发 现可能导致蛋白药物质量问题的潜在风险。

质控部门的工作要求其成员能熟练进行 多种不同的分析实验操作。相对于其它技术 而言，质谱分析更为复杂，难度相对较大。 为了提升工作效率、降低质谱使用进入门槛， Orbitrap系列质谱采用了尽可能简化的操作界 面设计，即使没有质谱操作经验的人员，也 可以在一个工作日内掌握仪器的日常维护、 校正、采集方法设置等操作。但是对于质谱 数据分析工作来说，不可能一蹴而就，而是 需要经验积累的。为了帮助使用者能更快地 具备丰富的质谱分析经验，PepFinder特意设 置了理论图谱功能（图6）。此功能可根据肽 段的氨基酸序列，通过Kinetic Model计算出肽 段的理论碎片图谱[6-11] ，并与实验图谱对比显 示。这样就为实验人员提供了为直观的质谱图谱观察途径，可辅助判断图谱质量，并 可帮助分析者快速积累质谱分析经验。 

肽图分析是蛋白质药物研发及质控为常 用的分析手段之一。其可以提供为精细的 序列结构及修饰信息，因此参与到了细胞株 筛选、细胞培养、纯化、制剂工艺优化等各 个阶段。在每次分析中，都需要从肽图数据 中挖掘出大量重要的信息，使其成为质控与 研发分析中较为繁重的一项工作。PepFinder 直接基于Amgen的一线分析需求进行设计开发， 并经过了多年的内部使用，因此成为蛋白药 物质谱数据分析中的软件。 PepFinder与Orbitrap系列质谱的联合运用已成 为业内*的实验分析平台。

更多产品信息请点击：赛默飞Orbitrap型质谱仪