基于 Orbitrap平台的简单快速抗体药物天冬氨酸异构化解析

关键词 Fusion、 Proteome Discoverer、单抗、天冬酰胺脱氨基化、 天冬氨酸异构化 

1. 前言
进入临床实验和正在研发的单抗药物日趋增加，对于单抗 药物的安全性和有效性评价的测试也越发重要。与小分子 药物相比，单抗药物更易在生产、运输和储存的过程中， 发生各种翻译后修饰的变化，比如单抗中甲硫氨酸和酪氨 酸氧化，天冬酰胺脱酰胺化，天冬氨酸异构化等都会影响 药物分子的稳定性，同时影响蛋白的结构和功能。因此， 对各种翻译后修饰的质控分析也提出了更高要求。目前使 用 LC-MS/MS 在线分析质谱技术，在常规的肽图分析中， 可以同时对多种翻译后修饰进行定性和定量分析，比如甲 硫氨酸氧化、N 糖基化、天冬酰胺脱酰胺化，但对于天冬 氨酸异构化我们关注的都比较少，本文我们为大家提供更 加完整的天冬氨酸异构化解决方案，有助于单抗药物的精 细质控分析。

天冬氨酸（D）异构化是一种自发性的非酶翻译后修饰， 发生异构化后的天冬氨酸（isoAsp）, 在蛋白骨架中插入了 一个亚甲基，也就是同时天冬氨酸侧链减少了一个亚甲基， 如图 1 所示，因此引起蛋白结构的变化，从而引起蛋白功 能的变化。抗体 CDR 区域中天冬氨酸异构化已被证实会 降低受体结合效率，影响终的药效。位于铰链结构区域， 或者位于 DG/DS（G 为甘氨酸，S 为丝氨酸）区域的天冬 氨酸易发生异构化。同时在弱酸性溶液中，会增加天冬氨 酸异构化的水平。在天冬酰胺（N）发生脱酰胺化时，会 伴随带来天冬氨酸异构化，并且异构化的水平和非异构化 的水平基本在 3:1 的比例，一般包含 NG 区域和 PENNY（P 为脯氨酸，E 为谷氨酸，Y 为酪氨酸）区域的天冬酰胺易发生脱酰胺化，并带来天冬氨酸异构化。由于异构化本身 不会引起分子量和电荷的变化，因此大大增加分析的难度。 在完整蛋白的水平上，可以使用离子交换和亲和色谱进行 天冬氨酸异构化分析，不过对于低丰度的异构化水平就无 法准确确定，因此，我们需要在肽段水平上进行天冬氨酸 异构化的分析，当使用反相色谱（RP）进行分析时，一般 异构化的肽段会优先于未异构化的肽段被洗脱下来，不过 在受到柱子填料和流动相添加离子对试剂等因素影响时， 同样会出现晚于未异构化肽段流出的现象。目前，在常用 的碰撞诱导激活解离（CID）和高能碎裂（HCD）进行二 级碎裂时，无法通过碎片离子进行天冬氨酸异构化的确认。 ETD 作为一种补充碎裂方式，尤其在进行长肽段，翻译后 修饰肽段和完整蛋白水平分析时，可以提供与 CID/HCD 互补以及 ETD 特征性的碎片离子，从而准确的确定氨基酸 序列以及翻译后修饰位点的信息。本篇中使用电子转移解 离（ETD）时，包含天冬氨酸异构化的碎片会产生相应的 特征质量增加，如图 2 所示，因此可以准确的判断天冬氨 酸异构化的位点。

本文基于Thermofisher 新的三合一超高分辨质谱仪 Orbitrap Fusion Lumos, 采用ETD 碎裂方式，建立了天冬 氨酸异构化质谱解析方法，可以广泛的应用到常规抗体药 物肽段的精细解析中

2 实验部分

2.1 仪器和试剂
质谱仪器：Orbitrap Fusion Lumos（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Easy nLC 1000液相色谱系统（赛默飞世尔科技， 美国）；
Dione×3000UPLC超高压常规液相系统（赛默飞世尔科技， 美国）；
色谱柱：Home made Nano column（C18，2 µm， 75 µm×150 mm ，100 Å）；
Waters BEH（C18，1.7 µm，2.1×150 mm ，100 Å）
试剂：质谱级甲酸、二次去离子水，质谱级乙腈

2.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 1；
质谱分析参数：具体见表 2；

2.3 数据分析方法
使用Proteome Discoverer2.1 软件对原始谱图进行氨基酸序 列分析，数据库为抗体药物对应的氨基酸序列，具体搜库参 数为：半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修 饰；甲硫氨酸 (M) 氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷 氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）设置为可变修饰；酶切 为 trypsin；酶漏切位点为 2。

3. 结果与讨论

经过 PD 检索之后，通过设置脱酰胺化后修饰和查找包含 天冬氨酸异构化的特征碎片离子，在该抗体的酶解肽段中， 终准确鉴定到发生天冬氨酸异构化的肽段有两条，该结 果与文献报道的易发生天冬氨酸异构化的肽段一致 [1,2]。
条发生天冬氨酸异构化的肽段为 VVSVLTVLHQDWLNGK， 其二级碎裂谱图如图 3 所示，其中第 14 位的 N 发生了脱 酰胺化，并且在该过程中，产生了异构化的天冬氨酸，我 们可以观察到 c13 和 c13+57 两个特征碎片离子，如图 4 所示，因此可以准确确定异构化的发生，同时我们也进行 了一级峰提取，不过由于这条肽段的非脱酰胺化形式和发生天冬氨酸异构化的形式疏水性差别不够明显，或者说目 前使用的反相色谱柱还没有足够的分离能力，因此该肽段 的不同翻译后修饰形式无法得到有效的色谱分离，从而无 法进行准确的定量分析，期间为提高色谱分离效果，我们 尝试使用常规液相分析，但是没有得到很好的分离效果， 另外由于使用常规液相，反而降低翻译后修饰肽段的检出。 因此，推荐在不进行定量分析的情况下，我们优先考虑纳 升级液相和质谱联用进行高灵敏度的肽段翻译后修饰检 测。

第二条包含异构化位点的肽段为 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK， 其二级碎裂谱图如图 5 所示，其中第 14 和第 19 位的 N发 生了脱酰胺化，并且在该过程中，第 14 位的天冬酰胺发生 了异构化，我们可以观察到 c13 和 c13+57 两个特征碎片离 子，如图 6 所示，因此可以准确确定天冬氨酸异构化的发生。 同样由于色谱分离度不够，因此无法进一步的定量分析。

4. 结论 本文基于新的三合一超高分辨质谱 Orbitrap Fusion Lumos 分析平台, 采用ETD 碎裂方式，建立了天冬氨酸异构化质 谱解析方法，为单抗药物的准确、快速、精细解析提供了可 靠的分析手段，尤其当一些药物质控分析中出现异常电荷异 质性或药物异常降解时，可以进行肽图水平的质谱分析