“肽”厉害： 单杆液质在线除盐结合解卷积定性合成寡肽

原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国

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史华进冉良骥

随着多肽合成技术的不断发展和日趋成熟以及GLP-1受体激动剂（如利拉鲁肽和司美格鲁肽）的走红，肽类药物逐步成为众多生物药企重点关注的研发管线之一。由于多肽分子大小介于传统小分子化药和蛋白类生物药之间，因此具备两者的一些特性。为指导化学合成多肽药物药学的研究，2月21日，国家药监局药品审评中心发布《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》，其在质量研究与控制部分介绍了使用LCMS鉴别合成肽。赛默飞单杆液质在线除盐结合解卷积功能以及完善的液相色谱产品及解决方案，可以助力肽类药物的工艺研发及质量研究和控制工作。

寡肽定义 

寡肽一般指由2-20个氨基酸残基通过肽键连接形成的生物活性肽，通常也被称作小肽，低聚肽或者小分子活性肽。相较于小分子药物，寡肽药物具有更好的靶向性，而对于蛋白质和多肽，寡肽分子量更小，结构更简单更容易渗透到目标组织。

合成肽中的杂质 

固相肽合成技术因其效率高，操作简单等优势，已成为主流的肽合成技术。合成过程中难免会形成相关杂质，包括合成工艺中氨基酸丢失，插入或错配，以及脱酰胺、氧化或异构化等降解杂质。

质谱前端在线除盐 

液相质谱联用（LC-MS）技术作为现代常见的有机化合物定性手段，已被广泛用于合成路线中主化合物及有关杂质鉴定。虽然目前为止，TFA是主流的离子对试剂用于合成肽样品分离，不过对于有些难分离的化合物依然需要采用磷酸盐体系改善分离。质谱使用者都熟知，像磷酸盐这类不挥发性盐不能直接进入质谱，这对于直接用质谱定性方法中的有关杂质增加了难度。为了解决上述问题，二维在线除盐技术日趋流行。一维色谱保留原不挥发性盐体系方法，二维采用挥发性的流动相将目标物送入质谱鉴定。赛默飞双三元液相色谱系统（图1），采用独特的双泵设计，每个泵可作为一个单独的运行体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，可同时分别控制三条流动相流路，轻松实现二维在线除盐功能。

图1：双三元泵外观

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双三元二维在线除盐方法设计 

采用双三元二维液相色谱系统构建的质谱前端在线除盐流路如图 2 所示，质谱前端在线除盐技术过程一般主要有三个步骤，主要利用柱温箱上的两个2位6通阀切换技术，控制不同流路间的联动。实验首先对原来含有不挥发性盐流动相方法进行重现，确定待切组分的出峰时间，设定切阀时间。由图2可见，柱温箱上阀带有样品收集环，本实验配置的样品环为500 μL，结合一维色谱流速为1.0 mL·min−1，因此，最大的收集时间为0.5min，通过阀切换技术可以将目标组分（流动相含有不挥发性盐或离子对试剂）收集于环中，非目标组份可直接经由阀排入废液；然后收集好的组分会由配有质谱兼容流动相的双三元左泵带入在线除盐小柱，目标组分先保留在除盐柱上，不挥发性盐在除盐柱上无保留，因此直接流入废液。最后，待盐全部流穿后，通过下阀阀切，改变左泵梯度，将目标组分带入质谱仪进行定性分析。

图2 双三元二维在线除盐系统流路图

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质谱解卷积 

多肽分子使用电喷雾离子源（ESI）时，由于其存在多个潜在电荷位点，质谱图中会出现多个电荷对应的不同m/z离子信号。通过这些离子峰不能直接获取多肽分子的准确分子量。根据多电荷离子碎片的质荷比推算单电荷多肽的分子量这一方法被称为电荷解卷积，质谱图通过解卷积处理后可以直接获得多肽的准确分子量。

仪器配置 

Vanquish Core系列液相色谱仪：

双三元泵：VC-P33-A-01；

自动进样器：VC-A12-A-02；

柱温箱：VC-C10-A-03（配置两个2位6通阀，500uLloop环）；

DAD检测器：VC-D11-A；

VWD检测器：VC-D40-A；

ISQ单杆质谱检测器；

变色龙色谱管理软件 Chromeleon CDS 7.3.1配备去卷积权限PN:7200.0046

结果与分析

按一维分析柱条件运行一维色谱，可以得到一维紫外色谱图。如图3所示，主化合物出峰时间为35.947 min，在16.523 min处有一个杂质，为此次实验研究杂质。通过一维色谱图可以确定样品环的收集时间或阀切换时间，根据一维色谱出峰时间，设定第一次切阀时间为16.3min，即一维待测组分转入样品环，第二次阀切时间为16.8min，即二维流动相将组分带入除盐柱，进行在线除盐，然后待盐除去后，设置下阀切阀时间并调节流动相比例，将待测物转入质谱。

图3 寡肽样品一维紫外检测器色谱图

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因质谱不能使用不挥发性盐流动相，为尽可能降低其进入后端质谱风险，实验前期采用紫外检测器研究切阀及二维色谱条件，监测待测物是否成功切入二维。由图4可见，按二维除盐柱条件运行二维色谱，22分钟前，在高比例水相条件下除去不挥发性盐，然后26分钟提高有机相比例，即将待测物成功转入二维检测器，在紫外检测器中出锋时间为26.94min，且峰形良好。

图4 寡肽样品二维紫外检测器色谱图

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待二维方法确认后，将质谱检测器串联到二维紫外检测器后，按照色谱及质谱条件运行系统，如图5所示，在质谱总离子流色谱（TIC）中，待测杂质峰出峰时间为27.0min且质谱响应较高。

图5寡肽样品二维质谱检测器总离子流图

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通过Chromeleon数据处理软件去卷积功能，可通过去卷积算法，将系列离子峰转化为单个分子质量。图6中展示了软件通过算法可以获得离子峰对应的电荷数分布及该寡肽的分子量。

图6 变色龙软件去卷积处理后待测杂质质谱结果

（1）进样序列；（2）目标组分列表；（3）去卷积参数设置；（4）和（6）总离子流图；（5）全扫描质谱图；（7）去卷积谱图；（8）源质谱图；（9）去卷积结果组成列表。（点击查看大图）

小结

利用双三元二维液相仪器，一个泵模块，可以发挥两个泵的功能，开展在线除盐技术，操作简单，节省台面空间。除盐后，组分可以直接进入质谱检测器，进行后续定性工作。整个过程完全自动化，可以确保实验重现性，提高分析效率，节省时间。数据采集后，结合变色龙软件质谱去卷积功能，对数据进行处理，可以快速获取寡肽样品有关化合物的电荷分布及分子量结果。因此，本研究可以辅助寡肽合成工艺，获取目标峰分子量，为寡肽合成终点控制，中间体控制，杂质确证，合成路线优化等工作提供指导意义。

参考资料：

《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》

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