查异析微|赛默飞培养基液相解决方案

吴燕娇 冉良骥

细胞培养是细胞和分子生物学所使用的一项重要技术，为细胞正常生理和生化研究（如代谢研究、衰老研究）、药物和毒性化合物对细胞的作用、以及致突变性和致癌性研究提供了上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物（如疫苗、治疗性蛋白质）的大规模生产。自从1955年Harry Eagle博士在《Science》杂志上发表研究文章并发布“一个包含无机盐、糖、氨基酸、维生素及其他必须营养物质的等渗透压且具有pH缓冲能力的混合物”细胞基础培养基配方以来，众多生物制药团队对培养基的开发与优化从未停下脚步。2000年后，化学成分明确的细胞培养基，逐渐成为细胞培养基开发的主流，用以支持高密度培养及高产物表达的研究。

以赛默飞Gibco™细胞培养基为例，经过严格的工艺控制和污染检测，其质量、安全性、批间一致性和合规性均得到保证，可以满足客户从基础研究到放大生产的特定细胞培养需求。

赛默飞Gibco细胞培养基系列产品

不同类型的培养细胞（点击查看大图）

通常培养基的成分和配比需要进行针对性的调整，才能满足不同培养底物的生长需求。PaulJ.Price[1]在2017年发表的一篇文献就详细的描述了培养基的成分对细胞生长的影响。在本文中，我们尝试结合Thermo Scientific™ Vanquish™ Duo液相色谱及Thermo Scientific™ CAD电雾式检测器对培养基中各类基础组分进行了分析，可以作为培养基生产研发企业与生物医药研发企业的参考。

本方案分为四个液相方法。方法1测定培养基中的糖，方法2测定培养基中的核苷酸，方法3测定培养基中的氨基酸，方法4测定培养基中的维生素。大部分氨基酸紫外吸收较弱，通常需要经过合适的衍生试剂经衍生化反应增加发色团后，再使用UV检测器进行测定。由于衍生化反应操作比较繁琐、以及对衍生化效率、氨基酸衍生物稳定性方面的考虑，我们采用CAD电雾式检测器对氨基酸进行不衍生直接测定。CAD检测器较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势，分析物既不需要发色团也不需要离子化，适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测，可以实现糖与氨基酸高灵敏度检出。培养基成分复杂，需要采用不同的检测器分析不同的组分，在一定程度上可能会影响实验效率，赛默飞Vanquish Duo液相特有的双泵、双针自动进样器，则可以实现一套仪器两条流路(left、right system)独立运行，无污染无干扰且高效的进行分析，有效解决分析痛点的同时，同时获得事半功倍的效果。

Vanquish CAD示意图

Vanquish Duo液相系统连接示意图及并联工作流程

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方法一：

每一个生长培养基都需要碳源，以供细胞新陈代谢。碳源通常是葡萄糖，也可以是其他糖类，如半乳糖、己糖、蔗糖、果糖或其他碳源(如丙酮酸，谷氨酰胺)等。采用Vanquish液相系统及CAD电雾式检测器测定培养基中葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等组分。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖CAD测定图谱

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方法二：

在低血清、无血清细胞培养基中，为满足细胞生长增殖需要，常常添加一些成份：蛋白质、多肽、核苷、嘌呤、柠檬酸循环的中间产物、脂类、及一些血清替代因子等。随着细胞的不断分裂，DNA不断复制，细胞内部原有的的核苷酸不足以保证DNA的顺利完成复制时，就必须要从培养基中摄取核苷酸供细胞的DNA复制需要。采用Vanquish Duo HPLC系统，Hypercarb石墨化碳色谱柱，UV检测器测定5种核苷酸。

五种核苷酸测定图谱

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方法三：

所有的培养基配方含有10种必需氨基酸以及半胱氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸。在一些培养基中还需要加入其他非必需氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸)，可以减少细胞的代谢负担，从而达到细胞增殖的目的。采用CAD电雾式检测器与Hypercarb石墨化碳色谱柱无需衍生直接测定培养基中20种氨基酸。

氨基酸无需衍生电雾式检测器直接测定培养基中20种氨基酸谱图（点击查看大图）

氨基酸测定线性图谱

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方法四：

维生素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。水溶性维生素主要包括泛酸、维生素B12、叶酸、烟酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、胆碱、肌醇等。赛默飞Vanquish液相结合紫外检测器，可以有效检测培养基中水溶性维生素。

水溶性维生素测定图谱

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结论：

Vanquish Duo搭配紫外、CAD等检测器，可以高效、灵活地解决培养基中各类基础组分分析的难题。与质谱方案相比， Vanquish Duo液相结合CAD检测器的并联分析方案能有有效降低仪器配置成本，人员操作难度，更适合在QC实验室进行推广。

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参考文献：

[1]. Price, P. J. (2017). Best practices for media selection for mammalian cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 53(8), 673–681. doi:10.1007/s11626-017-0186-6

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