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采用安捷8800电感耦合等离子体串联质谱仪测定多肽和磷酸肽

2024年09月04日 11:11 来源:上海斯迈欧分析仪器有限公司

结合毛细管液相色谱分离技术Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪 MS/MS 质量转移模式下可痕量测定磷酸肽中的磷与含硫多肽中的硫使 LC-ICP-MS 可获得含硫和含磷物质的绝对检测限分别为 11 fmol 6.6 fmol)。硫的同位素比值测定结果与其理论值高度吻合从而证 明干扰得以有效消除所观测到的硫和磷的峰形和信噪比表现优异测定结果 表明 capLC ICP-MS/MS 联用技术在使用非特殊标样测定含硫和含磷多肽的 高灵敏度和同时绝对定量分析方面有巨大潜力


LC-MS/MS 用于定量分析制药/生物制药和临床研究中的 目标蛋白质此方法常常使用同位素标记的合成蛋白质和 多肽作为内标来定量分析相应的目标化合物与之相反LC-ICP-MS 通过测定目标化合物中含有的杂原子硫和磷对 蛋白质和多肽进行非特异性定量分析通过这种方式可以 使用含有杂原子的不同化合物并将单个含杂原子的非蛋 白质化合物作为通用标样对其进行定量不幸的是硫和 磷的检测限因其高电离能和单四极杆 ICP-MS (ICP-QMS) 的多原子干扰而大打折扣——即使使用了碰撞/反应池 (CRC)虽然扇形磁场高分辨 ICP-MS (HR-ICP-MS) 也被用 于该类应用但迄今为止仍没有任何 ICP-MS 仪器能够达 到已报道的 ESI-MS/MS 仪器使用同位素标记合成多肽时 所具有的检测限特别是对于硫)。1 列出了关于 LCICP-MS 对于硫和磷检测限的已发表数据包括所用的 ICPMS 技术和分离技术在这项工作中我们采用了 Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪也简称为 ICP-MS/ MS通过对硫和磷杂原子进行绝对定量分析来测定蛋白质 和多肽


较之传统的仪器或 ICP-MSAgilent 8800 在八极杆反应 (ORS3 ) 和四极杆质量过滤器 (Q2) 前方配备了额外的主 四极杆质量过滤器 (Q1)在该串联质谱结构中Q1 作为 单位质量过滤器仅允许目标分析物质量数的离子进入反应 排除了所有其他离子因为等离子体和基质中的离子 Q1 排除确保了即使在复杂高基质样品中ORS3 中的 反应过程也能得到精确控制从而实现准确测量并且灵敏 度也得到了极大的增强色谱分离过程通过与 8800 ICPMS/MS 联用的安捷伦 cap-LC 系统完成


实验 试剂和材料 超纯水Millipore东京日本),HPLC 和分析试剂级乙 腈以及甲酸Wako Pure ChemicalLtd.大阪日本)。 ICP-MS 标准品SPEX CertiPrepInc.MetuchenNJ美国)、对硝基苯酚磷酸二酯BNPP纯度 99%和蛋氨酸纯度 ≥ 99% 82)(Sigma AldrichSteinheim德国)磷酸肽标准品的氨基酸序列为 LRRApSLG KRSpYEEHIP含硫多肽标样为 ACTPERMAE VPMLK所有多肽购自 AnaSpecFremontCA美国),纯度 ≥ 95%

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制备含硫和磷的标样 使用 BNPP 和蛋氨酸在 1% 流动液相 B 基质中这是液 相色谱梯度淋洗的起始条件制备 02550100 200 ng/mL以硫、磷元素浓度计的含硫和磷的校准标样磷酸肽溶液的制备 分别配制三份溶液100 ng/mL以磷元素浓度计以确定每个多肽的保留时间和纯度溶液 1 包含 LRRApSLG ACTPERMAE而溶液 2 包含 KRSpYEEHIP VPMLK两种溶液中均包含大约 100 ng/mL BNPP 和蛋氨酸将溶 1 2 按重量法 1:1 混合配制成 3


仪器 

capLC 系统 Agilent1200 系列,采用 Agilent Zorbax SB C18, 5 µm, 150 x 0.3 mm 反相毛细管色谱柱的流动相 A B 分别包 含水和乙腈两种流动相都含有 0.1% 甲酸和 10 ng/mL 作为 ICP-MS 内标使用)。进样量为 1-2 µL液相色谱流 速为 5 µL/min液相色谱梯度淋洗条件如下0-3 1% B等度3-35 分钟1-60% B线性梯度Cap LC-ICP-MS 接口 使用安捷伦 capLC 接口安捷伦 G3680A 毛细柱液相色 谱接口套件1capLC 色谱柱连接到 ICP-MScapLC 接口结构为一个小的石英雾化室内包含一个消耗型 的雾化器


ICP-MS 使用 Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪80 mL/min 的流速从雾化气通道通入氧气:氧比例为 8:2到雾化器气体中池气体氧气流速为 0.35 mL/min样品流速5 µL/min31 P32 S 34 S 的积分时间 150 ms 每个峰值一个点)。使用配于 30% 的乙腈中 100 ng/mL 和硫的标样对 8800 进行优化,以满足低的磷、硫检出限 要求,流速为 5 µL/min注射泵进样使用Agilent ICP-MS MassHunter 软件进行液相色谱操作和对色谱峰进行积分


MS/MS 模式下使用 Agilent 8800 消除对硫和磷的干扰 8800 MS/MS 质量转移模式下操作以消除对硫和磷的干 在图 2 上方的示意图 (a) Q1 设为 m/z = 32从而允许 32 S + 进入反应池排除了其它质量数的干扰 包括质荷比为 48 的离子)。S+ 在池内通过与氧气反应转 换为 SO+Q2 设置为 m/z = 48从而允许 SO+ 进入检测 排除了 m/z = 32 的所有原始质量数干扰物m/z = 48 的干扰物在碰撞反应池之前已由 Q1 排除这是 MS/MS 结构具有强大消干扰能力的关键所在——实现了在可控条 件下进行准确无干扰的反应物离子测量

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2 下方的示意图 (b) 显示了对磷的测定设置Q1 设置 m/z = 31从而允许 31 P+ 通过排除了其它质量数的 干扰包括 m/z = 47)。31 P+在池内通过与氧气反应转换 PO+Q2 设置为 m/z = 47从而允许反应产物 PO+ 入检测器m/z 47 = 处的干扰物在碰撞反应池之前已 Q1 排除Q1 消除的干扰物包括:(m/z = 47 47 Ti +32 S14 NH+32 S15 N+15 N16 O+12 C35 Cl + 31 P16 O+ 的干扰以及 m/z = 48 48 Ti +36 Ar 12 C+P16 OH+31 P17 O+48 Ca+SO+的干扰),Q2 消除的干扰物包括:(15 N16 O+14 N16 OH+14 N17 O+12 C18 OH+31 P+的干扰以及 16 O+15 N17 O+15 N16 OH+14 N18 O+ 32 S+ 的干扰),如各图中 所示

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结论 对蛋白质中天然存在的 ICP-MS 可检测元素进行高灵敏度和 无干扰的定量检测将扩展 LC-ICP-MS 方法在蛋白质组学中 的应用通过与 cap-LC 分离方法联用Agilent 8800 感耦合等离子体串联质谱仪利用 LC-ICP-MS 分析含硫和磷 物质时可获得低检测限分别为 11 fmol 6.6 fmol)。 MS/MS 质量转移模式下操作时Agilent 8800 通过使 分析物与氧气反应并测量产生的氧化物离子从而有效消 除了对磷和硫的干扰硫的同位素比测量值与理论值吻合 良好,证明硫干扰物得以有效消除并且由于串联质谱模 式能保留正确的同位素模式可以通过同位素稀释法来校 正因梯度淋洗导致的硫灵敏度的变化。 所测得的含硫和磷物质及多肽的峰形和信噪比佳这也是将通用标样应用于多肽和磷酸肽的同步绝对定量分析这种全新的功能强大的硫磷特别是硫检测法将使 LCICP-MS 在诸多领域中得到应用如药物研究药物和代 谢物)、环境分析农药和纳米技术工程纳米颗粒的 表征

关键词: ICP-MS

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