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采用 LC/MS 鉴别人参制品及人参植物的种属差异

2023年06月01日 22:14 来源:上海斯迈欧分析仪器有限公司

摘要有历史记载以前,人们就已经开始用草药提取物治疗疾病。同种植物常常因地域、气候、生长条件或亚种不同,具有不同形式的活性成分。中药(TCM)中使用的一些植物就是例子。人参作为其中的代表,其亚种广泛分布在整个亚洲和美洲大陆。本应用报告报导了用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统,配置快速分离高通量(RRHT)柱,对复杂人参提取物中的组分进行分离的方法。用 LC/ESI 八极加速飞行时间(oaTOF)和 LC/离子阱质谱检测并鉴别了地域或生物源性不同的人参所含化合物的差别。基于已知的组分结构信息,通过测定组分谱图可为人参制品的鉴定提供证据


摘要有历史记载以前,人们就已经开始用草药提取物治疗疾病。同种植物常常因地域、气候、生长条件或亚种不同,具有不同形式的活性成分。中药(TCM)中使用的一些植物就是例子。人参作为其中的代表,其亚种广泛分布在整个亚洲和美洲大陆。本应用报告报导了用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统,配置快速分离高通量(RRHT)柱,对复杂人参提取物中的组分进行分离的方法。用 LC/ESI 八极加速飞行时间(oaTOF)和 LC/离子阱质谱检测并鉴别了地域或生物源性不同的人参所含化合物的差别。基于已知的组分结构信息,通过测定组分谱图可为人参制品的鉴定提供证据


实验部分仪器• 带脱气机的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。该泵能够用 1.8 µm 粒径 RRHT 柱进行高分离 HPLC 分析,以获得最佳分离性能• 带温度控制的 Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器(h-ALS SL)。该自动进样器为配合 1200 系列 SL 型二元泵使用而特别设计,具有低的延迟体积• Agilent 1200 系列柱温箱 (TCC)。该 TCC与 SL 型二元泵一起使用,在优化的延迟体积条件下可选择分离式热交换器和柱后冷却,并可选择 2 位/10 通阀进行交替柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器 (DAD)。该 DAD 能以高达 80 Hz 的采样速率采集数据,并具有内置数据存储功能• Agilent 6210 MSD TOF。八极加速飞行时间质谱仪,带双喷雾器接口以进行质量校正,能以最高的准确性获取分子质量数。该飞行时间质谱仪能以 40 Hz 速率采集数据,还能进行正/负切换• Agilent 6330 离子阱,用于 MSn 串联质谱实验的离子阱质谱仪,扫描速度高达每秒 26000 m/z,具有自动数据自适应MSn 功能• LC/离子阱仪器控制软件为化学工作站B01.03,离子阱软件 5.3,用离子阱数据分析软件 3.3 进行数据分析• LC/TOF 仪器控制采用 Mass Hunter 工作站进行数据采集,AnalystQS 进行数据分析• 色谱柱:ZORBAX SB-C18,2.1 x150 mm,1.8 µm


样品1. 粉碎的冻干人参 (1 g) (Panax ginseng)和 粉 碎 的 冻 干 西 洋 参 (1 g) (Panaxquinquefolius) 分别加入 10 mL 甲醇,超声处理 30 分钟,过滤后直接分析2. 糖浆——如韩国人参提取物药用制品(ILHWA Co., LTD, Korea) (1 g)溶解于100 mL 水/甲醇 (1/1,v/v)中,过滤后直接分析系统设置LC/MS液质联用仪 系统的设置如图 1 所示。Agilent1200 系列 SL 型二元泵通过一根 0.17 mm内径不锈钢毛细管与 Agilent 1200 系列h-ALS SL 连接。为减少延迟体积,h-ALSSL 的针座毛细管采用 0.12 mm 内径,用同样规格的毛细管在柱温箱中连接低延5989-5493EN 100迟体积(1.6µL)热交换器,柱温箱链接色谱柱。将 2 µL 流通池置于 SL 型 DAD 中用于 UV 检测。出口毛细管直接连在 ESIoaTOF 或离子阱质谱仪的电喷雾源喷雾器上。从人参(Panax ginseng)复杂天然产物提取物的 UV 分析可以看出,对仪器设置进行了优化以获得最高分离度[5]。使用 2.1 x 150 mm,1.8 µm 色谱柱,系统反压一般在 560 bar 左右。UV 色谱图中基线分离的色谱峰最大峰宽(FWHM)小于0.1 分钟。高分离配置的 Agilent 1200 系列二元泵系统的全部性能在另一篇应用报告中介绍[7]。只要稍加改动,这一系统也可以用于高通量分析[8]。


方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作条件如下:溶剂 A: 水 + 0.1% TFA溶剂 B: 乙腈+ 0.1% TFA流速: 0.5 mL/min梯度: 0 分钟 5% B1 分钟 5 % B60 分钟 85 % B61 分钟 95 % B70 分钟 95 % B停止时间: 70 分钟后运行时间: 15 分钟• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器进样 10 µL 样品,并将样品冷却到

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合物。实验证明,在离子阱 MS 基峰色谱图(图 2 和图 3)中,20 到 40 分钟之间洗 脱 的 主 要 组 分 为 常 见 的 人 参 皂 甙Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rc 和 Rd,以及特殊的人参皂甙 Rf 和 F11。1.8 µm 粒径色谱柱除了具有良好的分离度以外,其分离度还可以随温度改善。例如,在 50 °C 柱温下,所有人参样品中都含有的人参皂甙 Rem/z 946.5 [M+H]+ 和人参皂甙 Rg1 m/z823.5 [M+Na]+ 分不开(图 2),但在 80 °C时却能分离(图 3)。要用 LC/MS 区分人参和西洋参,异构体人参皂甙 Rf 和伪人参皂甙 F11 非常有用。对人参的分析显示,质子化和加合形式的人参皂甙 Rf 分别在 m/z 801.5 和 m/z 823.5 处。在 m/z801.5 处的异构体伪人参皂甙 F11 只能作为痕量化合物检测(图 3)。相反,西洋参中却含有大量伪人参皂甙 F11 ,而不含人参皂甙 Rf。


两种异构体都有相同的经验式 (C42H72O14)。这两种化合物是构造异构体,只在结构式上有区别。要区分这些种属特异性化合物的异构体形式,需要进行 MS/MS 实验。西洋参样品的离子阱MS/MS 实验表明,保留时间 28.5 分钟的伪人参皂甙 F11 在 m/z 309.1 处断裂为葡萄糖-鼠李糖二糖部分后,丢失 5 个水分子,依次在 m/z 475.4、457.4、439.3、421.3 和 403.3 处产生离子(图 4)。最后在m/z 143.1 处产生特殊的呋喃环碎片。为了确证所提出的碎片结构,我们用高分辨LC/MS oaTOF 高质量精度测量和经验式确证对该实验进行了重复(图 5)。以0.41 ppm 质量精度测量 m/z 801.4997的精确质量,确证了分子离子。以不到2 ppm 的质量精度确证了连续丢失 5 个水分子产生的 m/z 475.3782、457.3676、439.3569 和 421.3464 碎片的四个经验式。用 3.10 ppm 质 量 精 度 确 证 了 m/z309.1176 处断裂的二糖碎片,及 m/z143.1065 处小的呋喃环碎片(质量精度4.90 ppm)。图 5 中的表格列出了伪人参皂甙所有碎片的测量质量、计算精度。

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与之相比,保留时间 27.7 分钟的化合物是人参的特征组分,人参皂甙 Rf。LC/MS分析显示,该化合物也含有质子化的分子离子 m/z 801.5。这是该分子的典型碎片,可用于区分人参皂甙 F11。MS/MS 分析中,二糖链 m/z 325.0 裂解后,连续丢失4 个水分子(图 6)。得到的碎片离子质量为 m/z 459.4、441.4、423.4 和 405.4,不同于 F11 分子产物。没有见到 m/z143.1 碎 片 。为 确 证 鉴 定 结 果 进 行 了LC/MS oaTOF 分析。TOF 图谱显示分子离 子 m/z 801.4999, 质 量 精 度 为0.16 ppm(图 7)。以 0.9 到 1.6 ppm 的质量 精 度 确 证 了 丢 失 水 后 得 到 的 m/z459.3834、 441.3726、 423.3620 和405.3515 碎片。断裂的葡萄糖二糖的质量在 m/z 325.1134 处以 0.22 ppm 质量精度测定。图 6 中的表格列出了人参皂


关键词: 液质联用仪​

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