快速高分离度 LC/MS/MS 定量测定麦片中的水溶性 B 族维生素

引言水溶性维生素极性很强，在反相色谱柱上保留很差。在流动相中加入离子对试剂，如七氟丁酸能够明显改善这类化合物的分离和保留。然而，使用这类离子对也有缺点，它会在质谱仪中产生较高的背景信号。因此，我们使用具有专门保留亲水性化合物键合相的色谱柱，在流动相溶剂中加入甲酸铵，开发出快速灵敏的分析方法。本文使用的 Agilent 1200 系列液相色谱（LC）系统和亚-2-微米填料色谱柱用于快速高分离度分离。该LC 系统设计降低了延迟体积，增加了压力范围和柱温。将该 LC 系统通过 G1948B 电喷雾离子源与Agilent 6410 三重串联四极杆质谱仪（QQQ）相连接。目标化合物采用加入甲酸铵的水 - 甲醇梯度在ZORBAX AQ 1.8 µm 色谱柱上实现分离。测定水溶性维生素的普通的 LC/MS 方法是在流动相溶剂中加入七氟丁酸作为离子对试剂，其分析时间长达 30 分钟。我们开发出快速、灵敏的 LC/MS/MS液质联用仪 方法用于水溶性维生素的测定，该法采用高效 1.8 µm色谱柱在低扩散、600 bar LC/MS 配置下将允许筛选和定量的运行时间周期低至 10 分钟。质谱仪的线性响应超过三个数量级，除吡哆醇外的所有被测物具有0.5 pg/µL 的定量限。吡哆醇的分析具有良好的灵敏度，但良好的线性恰好被局限在三个数量级之内。对于除吡哆醇之外的所有化合物得出了浓度介于0.5 ～ 500 pg/µL 之间（吡哆醇介于 0.5 ～ 250 pg/µL之间）的校正曲线和色谱图。B 族维生素的结构示于图 1。

实验部分样品制备含有所有八种化合物的混标甲醇溶液由 ConAgra 食品公司提供，使用含 20 mM 甲酸铵和 0.1% 甲酸的10% 甲醇水溶液稀释至如下浓度：500、250、100、50、5 和 0.5 pg/mL。这些稀释液用于未知样品的定量测定。再提供一种按下列方法制备的添加 B 族维生素的样品，制备方法如下：

1. 使用搅拌器将早餐麦片研磨均匀；2. 称取 1 克研匀的样品转入 50 mL 样品瓶中；3. 加入 25 mL 0.1 M HCl，在 100 °C 水浴中加热 20分钟，以溶解维生素；4. 冷却至室温；5. 用去离子水调整体积至 1 L ；6. 用 0.45 µm 玻璃微纤维素膜过滤。应该指出，提供的添加样品是为测试仪器的灵敏度而研制，以向顾客演示为目的。一种典型的未添加样品的提取由以下步骤组成：取 1 克研匀的样品用酶消化处理以将天然存在的维生素从其结合形式中释放出来，定容至 10 mL，取其体积的 1/100 用于本研究所分析的添加样品。在较高的浓度下，可看到盐和其它基质成分对某些维生素的分析产生干扰。因此，可以采用进一步稀释的办法调节这些样品中的基质效应。

维生素 B12 母离子的质量（m/z 678.6）大约是图 1中给出的该化合物实验式（C63H88CoN14O14P）计算值的一半。相信此化合物不太稳定，在离子化过程中发生了裂解。

结果与讨论 ：有八个化合物的校正曲线示于图 2A ～ 2H。只有化合物吡哆醇在 500 ppb 水平没有得到良好的线性，本实验未加内标。