液质联用仪对尿样中的阿片类化合物进行定量分析

阿片类化合物是一类药用化合物，通常用于镇静和缓解疼痛，既可能作为处方药合法地获得，也可能通过非法手段获取。阿片类化合物的滥用常常会导致成瘾。出于一些原因，包括治疗药物监测、在药物影响下驾驶以及工作场所药物测试等，通常会对这些化合物进行分析，尤其是对尿样进行分析，因为尿样易于获得且样品量充足。在法医领域的检测中，如果该类化合物的含量超过管制值，还需要提供另外的确证信息以证明它们的存在。三重串联四极杆质谱仪能够提供灵敏度最高的定量方式，即采集由被分析物母离子裂解产生的具有最高响应的子离子（定量离子）的相关信号。这种裂解转变被称为多反应监测（MRM）。其次，通过采集次高响应的子离子（定性离子）的附加信号，可以认为能够获得足够的结构确证信息，尤其是当两种子离子的信号比在校正标准品和未知样品中保持一致时更是如此。使用液质联用仪同时采集定量离子和定性离子的 MRM 信号能够同时得到定量测定和结构确证结果。

安捷伦 MassHunter 软件在其定量分析程序中包含用户自定义离子比确证信息，如图 1 所示。用于确证的裂解离子比的缺省偏差限值为 ±20%，对于特殊用户，该值也可由用户自己设定。另外，最多可有四个不同的子离子被设为定性离子。本文中，使用了缺省值±20% 且仅用一个定性离子。

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本文使用梯度液相色谱系统，在 1.8 µm 粒径的快速分离高通量（RRHT）色谱柱上，在 3.5 分钟内对所有被分析物和相应的内标物质进行洗脱，所用的流动相仅包含水和乙腈（不含改性剂）。从一次进样到下一次进样之间的完整周期约为 8 分钟。这些化合物使用电喷雾离子源以正离子模式进行分析。与该离子源有关的参数如干燥气，与液相色谱的流速 0.4ml/min相适应，样品将由此导入质谱仪。

从离子源向液质联用仪质量分析器的最大离子转移电压由仪器的自动调谐功能进行设置，可以在较宽的质量范围内获得优化的信号强度、分离度和质量确证。一个需要根据每个被分析物进行优化的参数是碰撞诱导解图 2. 本文中分析的阿片类化合物的结构式离电压，它位于离子源和质量分析器之间的离子转移光学元件之上。通过优化，能够使得 QQQ 质量分析器中第一个四极杆上的母离子响应值最大。本次研究中采用 110 V 的碰这些参数设定之后，即可获得将母离子裂解形成最高响应的子离子的优碰撞能量。至此，关于定量离子的质谱方法学研究工作结束。接着，对次高丰度的子离子的碰撞能量重新进行优化，以上两种 MRM 是由同一化合物裂解而来的。上述优化步骤可以通过流动注射分析进行。

实验部分样品制备添加阿片类化合物的尿样有以下标示浓度：1，5，10，50，100 和 150 pg/µL，而 6-MRM 的标示浓度要低 15 倍。这些样品按下述步骤进行处理：1. 起始样品量为 250 µL2. 加醋酸钠缓冲液 500 µL3. 加葡萄糖苷酸酶 20 µL4. 加浓度为 500 ng/mL 的内标混合物（去离子水溶液）75 µL5. 涡旋振荡6. 60 °C 保温 2 小时7. 加去离子水 850 µL8. 涡旋振荡并离心9. 取上清液 200 µL 至样品瓶中所有制备好的样品均由客户提供。经过以上处理步骤，样品浓度稀释因子为 6.78，因此原尿样中 1 pg/µL 的浓度，其处理后进样的实际浓度为 147 fg/µL。通过加入内标物质和提取，各起始浓度的尿样其对应的进样浓度如下：0.147，0.737，1.47，7.37，14.7 和 22.12 pg/µL。按进样量 5µL（参见色谱条件）计算，以上浓度对应的柱上含量为0.737，3.685，7.35，36.85，73.5 和 110.6 pg。对于6-乙酰，各浓度值均为以上数值除以 15。

LC/MS 方法详细说明LC 条件Agilent 1200 系列二元泵，脱气机，多孔板进样器，以及柱温箱。色谱柱： 安捷伦 ZORBAX SB-C18，2.1 x 50 mm，1.8 µm 粒径（部件号：822700-902）柱温： 50 °C流动相： A= 水B= 乙腈流速： 0.4 mL/min进样量： 5 µL梯度：时间（分钟） %B0 24 40 Stop time: 6.1 分钟4.1 90 Post time: 2.0 分钟6 906.1 2进样针清洗（25:75 水/甲醇）— 冲洗进样针口 10 秒质谱条件模式： 使用安捷伦 G1948B 离子源的电喷雾离子化正离子模式雾化器： 60 psig干燥气流速： 11 L/min干燥气温度： 350 °CVcap： 2000 V分离度（FWHM）： Q1=0.7 ； Q2=0.7所有 MRM 的驻留时间 =50 毫秒所有转变的碰撞诱导解离电压 =110 V每个化合物的 MRM 及其保留时间见表 1。圆括号中的子离子为定性离子，其保留时间也在圆括

结果与讨论所有七个化合物的校正曲线如图 3A 至 3G 所示，包括三个低浓度的放大图。所有校正曲线由线性方程拟合而成，不强制过原点，权重设为 1/x。所有曲线的线性相关系数均不低于 0.99，并且在低浓度水平显示出良好的重现性和精密度。只有一个例外，其低浓度（柱上 49 fg）的三次进样中仅有两次有信号。然而，其对应的尿样浓度0.067 pg/µL（0.067 ng/mL）已远低于美国药物滥用与精神卫生服务管理局（SAMHSA）规定的工作场所测试管制值 10 ng/mL。