安捷伦三重串联四极杆LC/MS 系统定量测定氯己定中的 4-氯苯胺

 摘要：基因毒性杂质的测定是制药行业非常关注的问题，定量测定的主要难点在于实现足够高的灵敏度。由于多反应监测（MRM）具有高灵敏度和高选择性，串联质谱技术被用于对这类杂质进行定量。采用快速色谱可以实现高通量，并耗费较短的分析时间，并且可以提高色谱分离度

本研究使用安捷伦 6410串联质谱和 1200系列 RRLC，对氯己定中的 4-氯苯胺（一种降解产物）进行了定量测定。在0.3 ng/mL 到 1000 ng/mL 的宽浓度范围内线性相关系数> 0.9998。检测限（LOD）为 0.2 ng/mL，定量限（串联质谱）为 0.3 ng/mL。

前言芳香胺类由于具有亲电性，能与 DNA 形成强共价键，从而阻止了 DNA 的正确复制，被认为可以导致基因突变。4-氯苯胺是氯己定 (1, 1'-(己烷-1, 6-)双胍基])的降解产物，后者是牙科广泛使用的活性组分。加热可以促进 4-氯苯胺的生成 1。该化合物毒性很强，可以导致溶血和高铁血红蛋白血症 2,3。这说明了建立一种对氯己定中 4-氯苯胺稳定而灵敏的定量方法非常重要。本应用报告报导了一种简便而灵敏的LC/ESI/MSMS 方法，能够检测氯己定中0.2 ng/mL 浓度水平的 4-氯苯胺。氯己定和 4-氯苯胺的分子结构如图 1 所示。

实验化学药品及试剂氯己定 和 4-氯苯胺购自 Sigma-Aldrich 公司。所有溶剂均为 HPLC 级。甲醇购自Merck 公司，甲酸购自 Fluka 公司，采用Millipore 超纯水。仪器和色谱条件所有分析均使用安捷伦 6410B 三重串联四极杆质谱与 1200 系列 RRLC 系统联用。RRLC 系统组件包括安捷伦 1200 系列二元泵 SL，配置脱气机，安捷伦 1200 系列自动进样器 SL 和安捷伦 1200 系列柱温箱SL。用安捷伦 MassHunter 工作站软件（版本：B.01.04）进行系统控制和数据采集。

所有色谱分离均采用安捷伦 ZORBAXEclipse Plus C18, 4.6 mm × 100 mm,1.8 µm 色谱柱。 流动相有机相为含 0.1%甲酸的甲醇，水相为含 0.1%甲酸的水。线性梯度从 50%有机相开始，三分钟至 70%。继续维持 B 百分含量 1 分钟。梯度后时间为 3 分钟。用自动进样器进样 6 µL，打开冲洗口冲洗 10 秒钟。样品温度设置为 15℃。二元泵流速为 700 µL/min。柱温箱设置在40℃。稀释液是水相和有机相 1:1 预先混合的溶液。质谱参数列于表 1。4-氯苯胺的监测离子为 m/z: 128 和 93 (定量)、 m/z: 128 和 111 (定性)， 氯己定为m/z: 505.4 和 184.3。所有离子的驻留时间均为 200 ms/离子。样品制备用稀释剂将浓度为 500 μg/mL 的 4-氯苯胺储备液稀释成需要的浓度。配制的线性浓度分别为 0.2 (LOD), 0.3 (LOQ), 0.4, 0.5,0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000 ng/mL4-氯苯胺。每个浓度重复进样 3 次，用其响应值绘制线性曲线。

线性范围内各浓度的准确度（以百分比表示）良好，平均值为 102.2 ± 9%。所有浓度的准确度值列于表 2。

结论我们建立了稳定而灵敏的氯己定中 4-氯苯胺的 LC/ESI/MSMS 定量测定方法。该方法具有较宽的线性范围 0.3 ng/mL (LOQ)到 1000 ng/mL，相关系数>0.9998。所测LOD 为 0.2 ng/mL。 各线性水平的浓度准确度约为 102.2 ± 9.7%。实验表明，安捷伦6410B 三重四极杆 LC/MS 能够精确测定痕量基因毒性杂质 4-氯苯胺