血浆药物定量分析所需的高速、超高灵敏度和耐用性

摘要本文介绍了安捷伦 1200 系列高分离度快速液相色谱仪（RRLC）配合安捷伦 6460A 三重四级杆串联质谱仪在人血浆生物分析中的应用。高通量分析表现在：待测药物和内标物都能够在色谱中于 1 分钟内洗脱。超高灵敏度表现在：线性范围涵盖了人体血浆微剂量水平药代动力学研究的典型浓度范围（1–500 pg/mL 血浆浓度）。耐用性和重现性表现在：在上述浓度范围，5 天之内通过该LC/MS 系统可分析超过1000 个血浆样品。

引言使用 LC/MS 定量分析生理样本如血浆和血清中的药物，可以认为是药物发现中药代动力学（PK）研究的特征。通过 LC/MS分析得到的 PK 图线提供了候选药物的生物利用率和半衰期信息，以便比较并选出先导化合物用于进一步研究。制药行业需要灵敏度高、选择性好、耐用性强的分析方法，同时还应具有高通量，以便快速获得这些信息并迅速作出判断。由于由体外实验或动物实验的 PK 数据外推得到的人体剂量数据常常具有误导性，出现了“first-in-human trial”（人体试验，即人体微剂量试验）的概念，因而对生物分析的灵敏度设置了更严格的要求，即人体微剂量水平实验的药物用量必须要低于动物或体外实验模型中预期治疗剂量的1/1001–8。目的为证实安捷伦 1200 系列高分离度快速液相色谱（RRLC）与安捷伦 6460A 三重四级杆串联质谱联用系统的高通量、超高灵敏度和耐用性而设计了本实验。人血浆中添加药物的浓度设定在人体微剂量水平研究的典型范围（1–500 pg/mL 血浆浓度）。在随后的血浆检测中，五个工作日内完成了包含 1000 多个样品的分析序列（例如每天进样 200 次）。每天的分析序列之后都用血浆中药物的系列标样来评估系统性能。

实验仪器• 安捷伦 1200 系列 RRLC 系统，包括 SL二元泵、微量真空脱气机 、SL 柱温箱和SL 自动进样器。• 安捷伦 6460A 质谱仪• 安捷伦 20 通多用途真空处理站• 安捷伦 SampliQ 优化聚合物技术（OPT）萃取柱（30 mg）• 安捷伦 ZORBAX C18 Eclipse Plus 色谱柱 2.1 mm × 50 mm，1.8 µm• 安捷伦 Mass Hunter 工作站软件，用于仪器控制、数据采集及数据处理LC 方法操作条件流动相 A 水 [0.1% 甲酸（FA）]流动相 B 乙腈（ACN）（0.1 % FA）梯度设置 t (min) %B0 300.1 300.95 601 601.01 901.20 901.21 30流速 0.8 mL/min柱温 40 °C停止时间 1.5 min梯度平衡时间 2.5 min进样体积 8 µL洗针 10 s，乙腈/水 60:40 v/v(0.1% TFA)

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MS 方法操作条件扫描模式 采用 MRM MasshunterOptimizer 软件获得如表 1 中所示的优化条件。离子化模式 结合安捷伦喷射流技术的ESI 正离子模式干燥气温度 300 °C干燥气流速 11 L/min雾化器压力 20 psi毛细管电压 2000 V鞘气温度 400 °C鞘气流速 12 L/min喷嘴电压 0 V化学品人体血浆以及所有标准化学品（去甲替林、曲米帕明、甲酸（FA）购于 Sigma-Aldrich 公司（德国）。HPLC级水购自 Burdick & Jackson 公司（美国），HPLC 级乙腈和甲醇购自 Merck 公司（德国）。血浆检测校正标样：10 µL 去甲替林的参比标样（溶于乙腈/水 = 70:30，v/v）添加到 190 µL 人血浆中，用来配制空白溶液和在1 - 500 pg/mL 范围内的 6 个浓度的标样溶液，添加 400 µL 2% 甲酸和 20 µL 曲米帕明内标溶液，涡旋混匀。安捷伦 SampliQ OPT 固相萃取柱（30 mg）用 1 mL 甲醇和 1 mL 水（0.1% 甲酸）活化，加入样品混合物后先后用 1 mL 0.1%磷酸和 1 mL 5% 乙腈溶液淋洗，然后用200 µL 乙腈/水 = 70:30（ v/v）洗脱，提取物用水稀释 2 倍，使溶剂组成与流动相初始比例相似。血浆样本按相同步骤进行处理，4000 rpm 离心 5 分钟后进样

结果与讨论基质效应和回收率通过新型 SampliQ OPT 填料获得的基质效应因子和回收率分别参考 Zweigenbaum等提出的公式（1）和（2）9,10。去甲替林标样配制两个浓度：500 和 100 pg/mL，添加后的血浆和空白样本，按前述血浆检测方法进行提取。空白提取液经缓速氮气吹干后用参比标样重新溶解。通过这种方法，就可在已提取添加溶液、提取后空白添加溶液和参考标样中获得相同的去甲替林浓度。将样品以1 µL 体积重复进样两次，取平均值进行计算。去甲替林浓度为 500和 100 pg/mL 时回收率分别为 97% 和95%。基质效应因子为 0.8。内标物曲米帕明的结果与之相近。高通量 LC/MS 方法图 1 是 SPE 提取物的典型 MRM 谱图。在提取前血浆中去甲替林的浓度为 500 pg/mL。去甲替林和内标物在 1 分钟内可以洗脱下来，证明该 LC/MS 分析的高通量特性，使用色谱柱交替再生技术还可以获得更高的通量。使用 RRLC系统，在进行此类 PK 分析时，分析周期时间（包括进样、样本分析、柱再生）可以低于1.5 分钟11。