气质联用仪系统分析豆奶中八种植物雌激素

摘要：本文应用安捷伦 7000 系列气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) 建立了豆奶中八种植物雌激素（包括鹰嘴豆芽素 A (biochanin A)，香豆雌酚 (coumestrol)，大豆黄酮 (daidzein)，雌马酚 (equol)，芒柄花素 (formononetin)，染料木黄酮 (genistein)，大豆黄素 (glycitein)和樱黄素 (prunetin)）的分析方法。用乙酸乙酯液液萃取法提取豆奶中植物雌激素，用三甲基氯硅烷 (TMCS) 和 N, O-双（三甲硅基）三氟yi酰胺 (BSTFA) 将分析物衍生成相应的醚，通过在不同裂解电压下形成的子离子和母离子推断各植物雌激素的裂解模式，得到各分析物相应的质谱图。由质谱裂解结果可知，各植物雌激素典型的裂解模式是失去甲基和羰基。每种分析物选择两个特征碎片离子进行鉴定、确认和定量分析。本方法适用于豆奶中植物雌激素的鉴定、确认和定量分析，且校准曲线的范围可达三个数量级。

引言植物雌激素是天然存在于多种植物中的一组非类固醇多酚化合物，它通过与雌激素受体结合诱导生物学反应。通常它们在豆科植物中的含量很高，例如大豆，三叶草，紫花苜蓿，黄豆和豌豆 [1]。类黄酮化合物（由 2-苯基-1，4-苯并吡喃酮衍生而来的水溶性植物色素）对人类的有益影响曾有报道 [2]，而且它们有清除自由基的作用。然而，伴随着废水中的合成激素和人类雌激素的排放，植物雌激素也被认为是潜在的鱼类内分泌干扰物 [3]。此外，在经常进食（每周进食两次以上）大豆食品的北美男性中发现植物雌激素，尤其是大豆黄酮，染料木黄酮和大豆黄素会导致精子数量减低 [4]。因为植物雌激素的排放不仅来源于植物也来源于人类和牲畜的食物摄取，因此评估食品中植物雌激素的来源以及地表水和废水中植物雌激素浓度十分必要。我们小组在前期的研究中发现大豆加工厂的废水会引起地表水中含有一定浓度的大豆黄酮和染料木黄酮 [5]。目前，已有几种定性和定量分析类黄酮化合物的方法，包括气相色谱法和液相色谱法 [6, 7]。在豆奶这种复杂基质中，由于基质干扰作用，具有选择性的离子阱或串联质谱法（液相色谱串联二级质谱或气相色谱串联二级质谱）成为了确认这些待测物的主要分析方法。总体来说气相色谱的相关检测方法对植物雌激素有很高的分离能力和低检测限，但是需要通过衍生化使其变为三甲基硅醚衍生物以增强其挥发性和改善热稳定性。二级质谱联用技术(MS/MS) 通过监测二个或三个特征碎片离子能够充分表征硅烷化植物雌激素，因此它比单一离子监测技术选择性高。本文使用 Agilent 7000 气相色谱三重串联四级杆质谱联用设备对豆奶中的八种植物雌激素进行鉴定和确认（表 1）。通过每种分析物的特征碎片离子对各植物雌激素进行鉴定。

实验部分样品制备与衍生化步骤鹰嘴豆芽素 A (biochanin A)，香豆雌酚 (coumestrol)，大豆黄酮(daidzein)，雌马酚 (equol)，芒柄花素 (formononetin)，染料木黄酮 (genistein)，大豆黄素 (glycitein) 和樱黄素 (prunetin) 购于Sigma Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。衍生化试剂N, O-双三甲基硅基三氟yi酰胺 (BSTFA)，三甲基氯硅烷 (TMCS) 购于 Sigma Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。取 500µL的 TMCS 加入到 5mL 的 BSTFA 中得到 10 % 的 TMCS 衍生化试剂。同样的方法将 2 mL 吡啶加入到 8 mL BSTFA 中得到 BSTFA吡啶 (4:1; v:v) 溶液，在进入气相色谱之前把它添加到干提取物中。甲醇和乙酸乙酯购于 Burdick and Jackson 公司（马斯基根，密歇根州，美国）。所有的分析材料和试剂均为分析纯。各种植物雌激素标样均由甲醇配制成浓度为 500 mg/L 的溶液。将这些溶液稀释成工作液用于衍生化反应和 GC/MS/MS 分析。所有标准溶液均储存在 –20 ºC 冰箱中，使用前在室温平衡至少 2 小时。用双三甲基硅基三氟yi酰胺 (BSTFA) 和三甲基氯硅烷 (TMCS) 将分析物衍生成其三甲基硅醚。首先在硅烷化的 5mL 反应瓶中用氮气将校准物质吹干。然后加入 200µL 10% TMCS/BSTFA 衍生化试剂，涡旋 15 s。反应瓶放在加热器中 60 ºC 保持 1 小时。将小瓶取出放置 15 min 冷却，然后用氮气将试剂吹干。最后将干的残留物溶于 200µL 用于进样的 4:1 BSTFA 吡啶溶液，涡旋振荡 30秒。用干净的玻璃吸管将衍生化的提取物转移到自动进样瓶中，使用气相色谱/质谱/质谱 (GC/MS/MS) 分析。使用乙酸乙酯作为提取溶剂建立了一个简单快速的从豆奶中提取植物雌激素方法。豆奶样品 (1 mL) 使用 5 mL 乙酸乙酯液-液萃取，氮气吹干后加入 TMCS 和 BSTFA/吡啶，在 60 ºC 衍生化 1 小时。

GC/MS/MS 仪器条件植物雌激素的气质法鉴定使用Agilent 7890气相色谱/ Agilent 7000三重串联四极杆质谱（Agilent，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）。色谱分离使用安捷伦 J&W HP-5 色谱柱（5 % 苯基，95 %聚甲基硅氧烷），30 m × 0.25 mm 内径熔融石英毛细管柱（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）内部膜厚度为 0.25 µm。载气为氦气，恒定流速为 1.2 mL/min 由电子压力控制系统调节。进样口温度为 280 ºC，不分流进样。程序升温为 100 ºC（保持1 min）40 ºC/min 升温至 240 ºC（保持 1 min）10 ºC/min 升温至300 ºC（保持 4 min）。质谱条件如下：正离子监测模式 (EI+)，使用自动增益控制 (AGC)，裂解电压为 –70 eV。离子源温度为300 ºC。增益电压为 30。每个 MRM transition 的驻留时间为50msec。进样量为1 µL。仪器控制和数据分析软件为MassHunter。

结果与讨论GC/MS/MS 条件的优化最初的试验包括两部分内容，首先是确定每种植物雌激素母离子的最大响应值，除鹰嘴豆芽素 A，染料木黄酮和樱黄素三种物质的母离子为 [M+•–CH3•] 以外，其它几种分析物的母离子均为其分子离子峰（见表1）。其次，选择合适的裂解电压以得到每种化合物的定性和定量离子 transition，裂解电压范围在 10-40 V，优化后的 MRM（多反应监测模式）transitions 如表 2 所示。表 2 列举了所有分析物的母离子和主要碎片离子，在有些情况下，碎片离子会发生三甲基硅烷 (TMS) 基团丢失，比如染料木黄酮和樱黄素，其他情况下，会发生一个甲基或一个甲基和一个羰基丢失，并伴随结构重排，图 1 为大豆黄酮的详细裂解模式，选择这些碎片离子对于分析物的定量和鉴定非常重要，而这通常不涉及TMS 基团丢失。因此，对每种分析物来讲，根据其相对丰度选择两个离子碎片进行定性和定量。与其他分析物不同，染料木黄酮丢失了由两个 TMS 基团组成的质核比为 72 的碎片，没有出现一个甲基和一个羰基的典型碎片丢失。

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分析方法验证分别配置 0.1、0.5、1、5、10、50 和 100 µg/L 的标准溶液做校准曲线，结果表明，所有分析物在 1-100 µg/L 范围内线性关系良好，图 3是大豆黄素的线性曲线，其中，相关系数 R2均大于 0.99，表 3 是各种分析物的仪器最检出限 (LOD)，检出限是大豆黄酮和樱黄素，芒柄花素的灵敏度低（响应值/浓度信号），因此 LOD 较高，批次内和批次间分析的变异系数 CV (n=3) 范围为2-8 %，说明方法重现性良好。豆奶中的分析应用图 4 是从当地食品商店中购买的豆奶的色谱图，其中，检出的染料木黄酮 (16000 µg/L) 和大豆黄酮 (7000 µg/L) 是豆奶中常见的两种植物雌激素，另外，本方法也检出了含量较低的大豆黄素(760 µg/L)，为了避免仪器信号超载，两种含量较高的分析物均被稀释以后进样，图4中还显示了染料木黄酮的两种 MRM transition和相应的离子比例，如图中所示，由于仪器的灵敏度和 MRMtransition 的高选择性，植物雌激素类化合物很容易被鉴别出来

由于分析物是比较复杂的样品，在使用 GC/MS/MS气质联用仪 时，保证仪器的相互适配是非常重要的，尤其是离子源和色谱柱。因此，在分析复杂样品尤其是杂质含量高的样品时，推荐使用反吹 [8]。

结论本文建立了八种植物雌激素（鹰嘴豆芽素 A，香豆雌酚，大豆黄酮，雌马酚，芒柄花素，染料木黄酮，大豆黄素和樱黄素）的三甲基硅烷衍生物的 GC/MS/MS 分析鉴定方法。研究结果显示，安捷伦 7000 系列三重串联四极杆串联质谱在分析豆奶样品中植物雌激素时稳定灵敏度高可靠性好。另外，通过在碰撞池中对母离子进行裂解研究了八种植物雌激素的裂解模式，结果表明，分析物典型的碎片丢失是失去甲基和羰基，为了定性定量准确，每种化合物选择两种碎片离子。本方法适用于豆奶中植物雌激素的鉴别和确认。