尿液中促蛋白合成类固醇代谢物的长期检测

摘要利用安捷伦 6890N 气相色谱串联 5975B 质谱和安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 建立了对尿液中促蛋白合成类固醇代谢物长期检测的方法。利用 GC/MS 的 SIM 模式监测代谢物的硫酸盐结合物，而不是常规的葡萄糖醛酸结合物，使美替诺龙（甲基雄烯醇酮）用药后能够被检测到的时间延长了两倍。使用三重四极杆 GC/MS 的 SRM 模式还可以进一步延长检测期限，几乎是常规检测葡萄糖醛酸结合物方法检测期限的三倍。

前言促蛋白合成雄性激素类固醇 (AAS) 的非医学使用在美国是违法的，同时也被大多数体育组织所禁止。然而，无论对于业余还是职业体育运动来说，AAS“兴feng剂”问题由来已久，并且在高中和高校竞赛中日益显现。1988，由于尿样中被检出司坦唑醇，短跑运动员本被取消参赛资格，已经取得的金牌和两项世界纪录也被取消。弗洛伊德•兰迪斯由于在筛查试验中被检测到睾丸酮/表睾丸酮比偏高，因此被取消了 2006 年环法总头衔，并被处以两年禁赛的处罚。熟悉反兴feng剂法规的违规者知道，如果在常规药检之前停药时间足够长，就可以在“训练时”“安全”使用而不被检出。因此违规者精心调整最后一次使用 AAS 的时间和兴feng剂检测尿样采集时间的间隔以确保检测结果呈阴性。因此，AAS 的可追溯检测是成功反兴feng剂不可少的。现在兴feng剂检测实验室都在寻找能够在停止使用后更长的时期内检测到 AAS 的方法。典型的尿液中促蛋白合成类固醇及其相关物质的兴feng剂检测方法是通过气相色谱/质谱联用 (GC/MS) 进行筛查。然而，传统的分析方法只能在用药后五天左右的时间之内检测到 AAS。通过使用能够检测到超低浓度 AAS 的仪器寻找和监测尿液中的长期代谢物以，就可以在用药后更长时期内检测到促蛋白合成类固醇 [1-3]。

本文介绍了使用安捷伦 6890N 气相色谱串联 5975B 质谱和安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 建立可以延长 AAS 检测期限的方法。对 AAS 的代谢物 —— 硫酸盐结合物的检测使本方法的建立成为可能，因为 AAS 的硫酸盐结合物比常规检测的 AAS 代谢物在人体内可以存在更长时间 [4, 5]。利用 6890N 气相色谱串联5975B 质谱，可以将 AAS 代谢物的检出期限延长至常规 GC/MS方法的两倍。而应用安捷伦 7000 系三重四极杆 GC/MS 可以将AAS 代谢物的检出期限延长至常规 GC/MS 方法的三倍，并且干扰少，灵敏度高。

实验部分标样及试剂实验所用标样及试剂见表 1。仪器使用的 GC/MS 是配有分流/不分流毛细管进样口的 6890N 气相色谱和安捷伦 5795B GC/MSD。使用的 GC/MS/MS 是配有分流/不分流毛细管进样口的安捷伦 7890A 气相色谱和安捷伦 7000系三重四极杆 GC/MS。仪器条件见表 2 和表 3。

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样品制备经固相萃取柱初步净化（去除尿基质）后，用 β-葡萄糖醛酸酶处理提取物以有效裂开葡萄糖醛酸结合物，产生游离类固醇。混合物过 C-18 固相萃取柱，用乙腈淋洗以去除未裂开的类固醇硫酸盐结合物和其他污染物。然后用甲醇洗脱酶解得到的游离类固醇，衍生化后用于 GC/MS 分析。

吹干含有类固醇硫酸盐的乙腈淋洗液，用 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶水解其中含有的硫酸盐结合物。再将水解提取物过 C-18固相萃取柱，用乙腈淋洗去除残存的污染物。用甲醇洗脱游离类固醇，吹干，衍生化后用于 GC/MS 分析。样品吹干，然后溶解在 100 µL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰an (MSFTA)- NH4I-乙硫醇 (100:2:3, v/w/v) 中，并在 65 °C 下衍生 15 min [3]。

分析参数不同 AAS 代谢物的 GC/MS 分析参数见表 4，三重四极杆 GC/MS参数见表 5。

结果类固醇代谢物的长期检测促蛋白合成类固醇及其代谢物以葡糖醛酸或硫酸盐结合物的形式随尿液排出体外，在分析之前首先要将类固醇解离。目前来源于大肠杆菌的 β-葡萄糖醛酸酶，经常被用在兴feng剂检测的常规类固醇分析中。然而，该酶不能裂开类固醇的硫酸盐结合物，因此在常规检查中以硫酸盐结合物形式存在的类固醇是“不可见”的。由于尿液中硫酸盐结合物比葡萄糖醛酸结合物存在时间长，所以如果某种方法能够使硫酸盐结合物“可视化”就能够实现类固醇的长期检测。使用 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和选择性提取步骤可以将促蛋白合成类固醇及其代谢物从硫酸盐结合物中释放出来。从尿样提取液的色谱图结果中可以看出，使用常规的 GC/MS 选择离子监测(SIM) 模式进行测定，可得到美替诺龙代谢物的葡萄糖醛酸和硫酸盐结合物分离的色谱图（图 1）。图 1 中下方的葡萄糖醛酸部分的色谱图显示了 3α-羟基代谢物及其母体结合物（17β-羟基）的存在。这两个化合物在兴feng剂检测中通常是常规筛查和步骤确证的目标物。图 1 中上方显示了硫酸盐提取物的色谱图，其中用红色标出的代谢物与 16-羟基 3,17-二酮结构相匹配。在这种情况下，18% 的羟孕酮代谢物是与葡萄糖醛酸相结合的（下方色谱图中 6.9 分钟时的红色峰）。而占 82% 的大部分的羟孕酮代谢物以硫酸盐结合物的形式被排出体外（上方色谱图）。通常，尿液中美替诺龙代谢物的葡萄糖醛酸目标物只能在口服药物后五天以内检测到。而美替诺龙的羟孕酮硫酸盐结合物可以用常规的 GC/MS 在口服后至少 9 天内检测到。硫酸盐结合的 16-羟基-3,17-二酮代谢物是 A 环中含有甲基的促蛋白合成类固醇中普遍存在的主要代谢物，包括司腾勃龙、羟甲雄酮和甲二氢睾酮（数据未列出）。

结论通过监测硫酸盐结合代谢物，而不是其葡萄糖醛酸结合代谢物，可以显著延长促蛋白合成类固醇的检测期限。使用选择性提取步骤和 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶可以将促蛋白合成类固醇代谢物从其硫酸盐结合物中释放出来，备衍生化和 GC/MS 分析使用。该步骤使用 GC/MS SIM 模式分析可以使某些促蛋白合成类固醇的检测期限由 5 天延长到 9 天，几乎是原来的两倍。在三重四极杆 GC/MS 联用仪上使用 SRM 模式，取出了基质干扰，可以将美替诺龙的检测期限由 9 天延长到 14 天。该系统还可以分析一些不易用传统 GC/MS SIM 模式进行分析的类固醇。因此，对于促蛋白合成类固醇的长期检测，三重四极杆 GC/MS 是传统GC/MS SIM 模式的一种较好的替代方法。