三重四极杆液质联用系统优化检测废水中的类固醇

引言：全球范围内的药品消耗量很高，而且由于医疗卫生条件的改进和平均寿命的延长，这个数量将持续增加。大量的药物及其代谢物被人类排出体外，进入污水处理厂，这些物质在污水处理厂未被*处理掉而最终留在了环境中。这些药物残留会对水陆生态环境产生负面影响。美国地质调查局（USGS）最近的一项研究发现 80% 的溪流水样中存在化学污染物，而类固醇是最常检测到的一类化合物。这些类固醇在很低的浓度就能引起生物学反应，包括雄性鱼的雌性化。加拿大一项延续七年的全湖实验表明，某鱼种持续接触类固醇17a-炔雌醇中会导致湖中该鱼种几乎灭绝 [1]。这些类固醇也有可能进入食物链以及饮用水中。欧盟水框架指令（2000/60/EC）[2] 提倡合理利用水资源，包括长期减少废水污染物如类固醇排放到水环境中。指令的实施需要一个灵敏、准确且可靠的检测方法来支撑。本文介绍了 2000/60/EC 指令中化学研究项目的部分内容，即采用配置 iFunnel 技术的 Agilent 6490 三重四极杆液质联用系统对类固醇的高灵敏度检测方法进行优化。该仪器可获得比以往仪器更低的检测限，从而使得在传统流速下就可以获得介摩级（zeptomole）的灵敏度，这使它成为重点药物分析应用的理想选择，如环境中类固醇的检测。

虽然早先的质谱仪器已经开发了类固醇检测和定量分析的液质联用的方法，但是，为了获得最高的灵敏度还必须在 6490 三重四极杆液质联用系统上对已有的方法进行优化。使用优化的参数检测废水中几种类固醇化合物，可以实现废水中低于 1 ng/L（万亿分之一）的检测限。

实验部分试剂和标准品乙酸乙酯、乙腈、异丙醇、环己烷和甲醇均为 HPLC 级或 glassdistilled 级。盐酸（37%）和氨水（30%）均为分析纯。硝酸铜是通用级别试剂或者更高纯度。水为 HPLC 级或者 Elga 高纯水。聚苯乙烯二乙烯苯固相萃取（SPE）小柱（200 mg）购自 Baker公司。GF/D 玻璃微纤维滤纸购自 Whatman 公司（Kent，UK）。雌酮、雌二醇和炔雌醇的乙腈溶液（浓度均为 100 mg/L）购自QMX Laboratories 有限公司（Thaxted，UK）。取一定量的上述三种溶液分别加入到甲醇中制成浓度为 1.0 mg/L 的校正标。用甲醇/水（10:90）稀释成浓度为 1、2、5 和 10 µg/L 的校正混标。这些混标中还包含 2 µg/L 的内标溶液。作为内标的氘代雌酮-D4、雌二醇-D5 和炔雌醇-D4 购自 QMX 实验室。各内标物先分别制成 100 mg/L 的乙腈溶液，再用甲醇稀释 制 成 1.0 mg/L 的 内 标 混 合 溶 液 ， 并 进 一 步稀释 成0.1 mg/L 的甲醇溶液。

仪器通过配备 100 µL 定量环的 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统与采用 iFunnel 技术的 6490 三重四极杆液质联用系统来实现方法 优化和废水分析。通过连接于色谱柱和雾化器之间的三通阀上的另一个外部泵来实现柱后加入 0.1% 的氨水溶液。仪器条件见表 1。样品采集、制备和净化用 2 L 的棕色玻璃瓶采集样品，同时加入 2 mL 浓盐酸和 0.5 g 硝酸铜，并于 10 °C 以下储存。对此保存条件下样品的稳定性进行14 天连续考察。样品提取后，提取物分析前在防爆冰箱中至少可保存 4 周。每个样品在萃取之前都要用 GF/D 滤纸过滤。1 L 样品中加入20 µL 内标混合溶液。100 mL 未经处理的污水样品中加入 900 mL水和 20 µL 内标混合溶液。样品采用已依次用乙酸乙酯（5 mL）、甲醇（5 mL）和水（3 mL）活化过的 SPE 小柱进行萃取。萃取柱上加样 250 mL，并依次用 3 mL 60% 甲醇和 3 mL 水进行淋洗。萃取柱真空干燥 40 min 后，用 4 mL 的乙酸乙酯洗脱。样品瓶置于 45 °C 的加热块上，洗脱液随着空气流蒸发，最后残渣用250 µL 的环己烷/异丙醇（95:5）复溶。萃取物用正相色谱法进行纯化，收集保留时间 5.8-8.6 min 的洗脱液。色谱条件如下：仪器：Agilent 1100 系列液相色谱仪；色谱柱：安捷伦 ZORBAX Cyano 色谱柱（部件号 883952-705），4.6x 150 mm，5 µm；柱温：55 °C；等度分离；流动相：环己烷/异丙醇（95 : 5）；流速：1 mL/min。样品瓶置于 45 °C 的加热块上，洗脱液随着空气流蒸发，残渣用 250 µL 的甲醇/水（90 : 10）复溶。最后得到终体积为 250 µL 的溶液，浓度相当于起始浓度的1000 倍。因此，校准标准溶液相当于原始浓度为 1、2、5 和10 ng/L。

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结果与讨论分析参数的优化虽然已经有用老型号的仪器分析类固醇的方法，但是为了充分利用采用 iFunnel 技术的安捷伦 6490 三重四极杆液质联用系统灵敏度，这些方法参数必须进行优化。为此以在 6460 三重四极杆液质联用系统上开发的方法作为基础进行参数的优化。碰撞池加速电压（CAV）是优化产物、检测和离子定量的关键参数。图 1 表明当加速电压由 5 V 变为 2 V 时，配制成标准校正溶液的 3 种类固醇物质的响应值显著增加。

倍增管电压（即 EMV 增益）是显著影响响应值的另一个参数。以100 V 的步长从 100 V 递增到 400 V，整个范围内的响应值增加了14 倍。当倍增管电压超过 400 V 时，响应值仍会继续增加，但信噪比保持不变甚至降低。实验发现最佳的电压值约为 200-300 V（图 2）。