液质联用仪分析苹果汁中的杀菌剂及其代谢物

引言：杀菌剂是一类用于抑制真菌生长的农药。由于食品中的杀菌剂残留引起人们对健康问题的广泛关注，因此欧洲、美国和其他许多国家都对其残留进行监管。多菌灵和噻菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂，而抑霉唑属于咪唑类农药。鉴于抑霉唑很容易代谢成 α-（2,4-二氯ben基）-1H-咪唑-1-乙醇，在抑霉唑的监管上，美国要求监测其母体及其代谢物的总和。2苯并咪唑类杀菌剂广泛应用于农业中的植物疾病控制和水果的采后处理。在美国，多菌灵（MBC）并没有登记使用，但在很多出口水果和果汁到美国的国家中多菌灵的使用却是合法的。另外，多菌灵是甲基硫菌灵（TM）的代谢物或降解物，后者被允许用于美国的许多农作物和草坪，这增加了人们接触到多菌灵残留的潜在风险。噻菌灵和抑霉唑常用于包括苹果在内的水果的采后处理如储藏和运输，且这两种化合物在美国是允许使用的。本文建立的简单提取程序可为目标被测物提供可重现的高回收率，这归功于安捷伦 Bond Elut Plexa 的*性能，这是一种为提高分析性能和易用性而设计的聚合物吸附剂。该吸附剂对于很多分析物均具有*的保留性能，此外，由于小粒径的 Bond ElutPlexa 填料不易引起堵塞，所以它能为小柱提供快速而可重现的流速。Bond Elut Plexa 提取物的洁净度降低了离子抑制效应，延长了 HPLC 色谱柱的寿命并使质谱仪器免受污染。

填充 2.7 µm 表面微粒多孔填料的安捷伦 Poroshell 120 EC-C18 色谱柱与亚 2 微米 UHPLC 色谱柱具有相似的柱效，但背压降低了40%。液相色谱系统分析时的实际压力不会超过 400 bar。高灵敏度的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统搭配 AJST 电喷雾离子源能为 4 个目标被测物提供低至 2 ppb 的优异检测性能。由于它大大低于任何现有的测试要求，我们的提取方法可以用灵敏度较低的老型号质谱仪检测，如 Agilent 6410 三重四极杆液质联用系统。使用灵敏度比 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统低的质谱检测器时，可以考虑在萃取过程中复溶这一步对样品进行预浓缩。之前安捷伦已经建立了苹果汁中多菌灵与噻菌灵的检测方法 [1]，该方法使用 Agilent Bond Elut SCX SPE 小柱净化，采用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18，3.5 µm 色谱柱结合带有可变波长检测器的 Agilent 1200 系列液相色谱系统进行检测。

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农药标准品购自 Sigma-Aldrich 公司（St. Louis, MO, USA）。内标（磷酸三苯酯）由安捷伦科技公司（Wilmington, DE, USA）提供。用甲醇配制成储备液（多菌灵的浓度为 0.25 mg/mL，其他 3个被测物和内标的浓度为 1 mg/mL），并保存于–20 ºC。

材料与仪器SPE: 安捷伦 Bond Elut Plexa 小柱 30 mg，3 mL（部件号 12109303）安捷伦 VacElut 20 固相萃取装置（部件号 12234100）安捷伦活塞阀 （部件号 12234520）安捷伦硅烷化自动进样小瓶，2 mL（部件号 5183-2072）安捷伦自动进样小瓶的螺纹口盖（部件号 5182-0717）LC: 安捷伦 Poroshell 120 EC-C18，2.1 x 50 mm，2.7 µm 色谱柱（部件号 699775-902）Agilent 1260 Infinity LC 系统（G1379B 微脱气机，低延迟体积配置的 1312B 二元泵，G1367E 自动进样器，G1330B 恒温器）MS: 配置 AJST 电喷雾离子源的 Agilent 6460A 三重四极杆液质联用仪

样品制备前处理向 0.5 mL 的苹果汁中添加 TPP（内标）使浓度为 50 ppb，建议使用 12 x 75 mm 的玻璃试管。用色谱纯的水按 1:3 稀释，涡旋，如浑浊需离心。澄清的苹果汁无需离心。提取1. 用 0.5 mL 甲醇对 Bond Elut Plexa 小柱进行活化（先浸透再滴放）2. 直接上样或者上清液上样3. 淋洗 1:1 mL 水4. 淋洗 2:1 mL 30:70 的甲醇水溶液5. 真空干燥 5～10 min（10～15 in Hg）6. 用 1 mL 乙酸乙酯/异丙醇（80:20）进行洗脱。先浸泡，再将洗脱液滴至收集瓶中。待洗脱液*流出后，于柱上加低真空（2～3 in Hg）7. 洗脱液在 55 ºC 条件下用氮气流吹干8. 用 0.5 mL 初始流动相复溶（10% 甲醇、90% 水、0.1%甲酸）

LC/MS/MSLC 条件流动相 A： 0.1% 甲酸水溶液流动相 B： 0.1% 甲酸甲醇溶液进样量： 5 µL流速： 0.5 mL/min梯度洗脱 时间（min） % B0.0 100.5 102.0 503.0 957.5 957.1 10停针时间： 7.2 min平衡时间： 2.5 min最大泵压力： 400 bar洗针： 甲醇/水（75:25）洗针时间 10 s禁止重叠进样无自动降低延迟体积功能MS 条件ES 离子源参数离子模式： 正离子毛细管电压： 2800 V干燥气流速： 12 L/min干燥气温度： 350 ºC雾化气压力： 40 psi鞘气流速： 12 L/min鞘气温度： 300 ºC喷嘴电压： 0 V4MS 参数扫描模式： 动态 MRM预运行脚本： SCP_MSDiverterValveToWaste(){MH_Acq_Scripts.exe}时间段#1:1.5 min 后切入 MS电子倍增管电压： (+) 400 V

结果与讨论4 种目标杀菌剂和内标（TPP）在 Bond Elut Plexa 小柱上均能得到有效的保留。Bond Elut Plexa 小柱中的吸附材料是极性增强的中性聚苯乙烯-二乙烯苯。这种吸附剂广泛适用于非离子型酸性、中性与碱性物质的提取。我们建立了一种非常简单的萃取方法，其中前处理是用水稀释苹果汁。如果苹果汁中有大量的果肉还需要进行离心，但大多数的苹果汁无需这一步骤。上样和淋洗步骤靠重力流动完成。只需在洗脱前加真空干燥 SPE 柱，洗脱后加真空使洗脱步骤回收率本文建议将第二次淋洗时的甲醇浓度由 5%（通用方法）增加到30%，会显著减少基质干扰。这使较早流出的多菌灵和噻菌灵的LC/MS/MS 灵敏度提高 30%，抑霉唑代谢物灵敏度提高 20%。抑霉唑峰面积保持不变。与 100% 甲醇相比，组合洗脱液（乙酸乙酯/异丙醇（80:20））对 4 个目标化合物的回收率略微有所提高，而疏水性强的内标（TPP）的回收率大约提高了 2 倍。表 1 列出了 4 种杀菌剂和内标的动态 MRM 转换参数，依次为定量转变通道和定性转变通道。Agilent Poroshell 120 EC-C18，2.1 × 50 mm，2.7 µm 色谱柱在 5 分钟内实现对 4 个杀菌剂和内标的分离。图 2 是苹果汁中添加 4 种杀菌剂（2 ppb）和内标（50 ppb）的 MRM 谱图。所有峰的信噪比均大于 100:1。显然，每个被测物的检测限均能达到 ppt水平。每个样品前 1.5 分钟的流出液切入废液以使离子源的污染最小。

结论本文采用固相萃取的前处理方法，结合 LC/MS/MS 检测技术，建立了一种准确性高，重现性好的方法，该方法简单有效。BondElut Plexa 吸附剂的性质使得该方法可以扩展应用于农药多残留检测。该方法中目标被测物 5 分钟内可以*分离，且在大多数安捷伦液相系统上都可以实现。该方法建立的 Agilent 6460 三重四极杆质谱优化参数可以被简单的修改后用于其他的安捷伦三重四极杆液质联用系统。当采用灵敏度较低的检测器时可以在萃取方法中的复溶步骤进行预浓缩。