三重四极杆气质联用仪统测定人尿中蛋白同化制剂

前言 在体育赛事中，为非法提高运动员的成绩滥用药物是世界反兴feng剂机构（WADA）严令 禁止的。WADA 每年都要公布违禁药物清单 [2]，并建立每个违禁药物的允许xian量 （MRPL）[3]。清单包括了几百种化合物，可分为 11 种不同的类别。尽管 WADA 从 1998 年成立以来付出了很大努力，但蛋白同化制剂作为一类滥用药物，其阳性检出率 始终维持着越来越高的趋势。由于蛋白同化类固醇激素代谢物，无论是外源性的还是内 源性的，均有可能存在于人尿中，对这类化合物的检测是一项艰巨的分析挑战。 2 由于通过 WADA 认证的实验室都被要求证明可以在 MRPL 水平 上对所有违禁药物进行常规筛查，每个实验室都创建了特定的 分析方法。这种反兴feng剂检测方法目前大多以两种仪器设备为 基础：单四极杆 GC/MS 系统和三重四极杆 LC/MS 系统。

然而，现在这个普遍采纳的方案可能要发生改变。安捷伦 7000 系列三重四极杆 GC/MS 联用系统采用 SRM 模式，可以极大地 提高违禁药物的检测灵敏度。应用此仪器为平台已经建立了某 些特定类固醇（甲醇和脱氢氯甲基睾酮的代谢物）的长期检测 方法 [4]，完成 150 种禁用药物的复杂检测仅需要 8 分钟 [5]。 从实用角度出发，三重四极杆气质联用仪GC/MS 筛查方法必须满足两方面 要求： 1. 可以检测到 GC/MS 和 LC/MS/MS 无法检测的 MRPL 水 平的化合物，例如 2 ng/mL的 17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b二醇（甲睾酮的代谢产物） 2. 可以在苛刻的情况下证明其稳定性 本应用介绍了使用 7000 系列三重四极杆 GC/MS 系统在 7.3 分 钟内筛查和验证 7 种蛋白同化制剂的检测方法 [1]，选定的目标 物包括 17a-甲基-5b-雄烷-3a、17b-二醇以及其他蛋白同化制 剂，使用三重四极杆 GC/MS/MS 检测这些化合物可获得比传 统 GC/MS 和 LC/MS/MS 更全面的信息。方法的稳定性通过两 个星期内对西班牙第十六届泛美运动会兴feng剂控制中收集到的 1367 个样本分析进行了验证。

实验 标准品和试剂 甲睾酮用作内标物，克伦特罗来自 Sigma 公司（圣路易斯市， 密苏里州，美国），17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b-二醇，3a-羟基 康力龙，16a-羟基呋咱甲氢龙，甲雄烯二醇，19-去甲雄酮和 19-去甲原胆烷醇酮购于 National Measurement Institute （Pymble，澳大利亚），β-葡萄糖醛酸酶制剂（E. Coli K12） 购于 Roche Diagnostics GmbH （Mannheim，德国），分析纯 磷酸氢二钠、磷酸氢钠、甲基叔丁基醚、氢氧化钾，碘化铵，乙 硫醇和甲醇购于 Merck 公司（Darmstadt，德国）。N-甲基-N- （三甲基硅烷基）三氟yi酰胺（MSTFA）购于 MachereyNagel （德国），超纯水用 Millipore Milli-Q Integral A 10 超纯 水系统制备。

仪器 本研究使用 7890 系列 GC 与 7000 系列三重四极杆质谱联用系 统，配置分流/不分流毛细管色谱柱进样口，使用选择反应监测 采集模式，仪器条件列于表 1。

样品制备 向尿样（2.5 mL）中加入 1 mL 磷酸盐缓冲溶液（1M，pH7）， 用 25 µL b-葡萄糖醛酸酶制剂在 55 °C 下培养 1 h。将样品冷却 至室温后，加入 135 µL KOH （5M）将 pH 调节至 9.5，再加入 5 mL甲基叔丁基醚进行液-液萃取。离心后，将有机层蒸发至干， 加入 59 µL MSTFA-NH4I-乙硫醇（100:2:6,v/w/v）在 60 °C 衍 生化 30 min，转移至进样瓶中。

采集参数 本分析使用的安捷伦三重四极杆 GC/MS 系统参数列于表 2。

结果 方法开发 质谱条件优化过程分两步进行。首先，采集每个化合物衍生化标 准溶液的全扫描谱图。分别采集全扫描谱图中的主要母离子在 5 个不同碰撞能量下的子离子质谱图。通过这些研究确定母离子和 子离子在选择反应监测模式（SRM）下的最佳仪器条件。 通过分析空白尿样萃取液和基体 5 倍允许限liang（MRPL）加 标萃取液对优化结果进行最终确定。对每一个可能的母离子，都 要在 5 个不同的碰撞能量下获取不同的子离子，包括前期实验确 定的最佳能量值。最后确定获得最大信噪比（S/N）而非最大绝 对响应的参数为参数，因为基体和内源性类固醇的背景噪声 会产生显著的影响。为了提高方法整体的定性能力，每个化合物 优化确定两个跃迁，表 2 汇总了为每个化合物建立优化条件后的 分析结果。