液质联用仪对动物源食品中的36种兽药进行筛查

 前言：QuEChERS 方法最初用于水果和蔬菜中的农药萃取 [1]。QuEChERS 操作分为两个步骤，萃取/分配和分散 SPE（dSPE）。在第一步中，乙腈作为萃取溶剂；使用硫酸镁和盐促进分配/萃取。在第二步中，采用 d-SPE 去除萃取物中的基质干扰。d-SPE 的材料一般包括 N-丙基乙二胺（PSA）、封端C18（C18EC）和石墨化碳黑（GCB）。通过验证，QuEChERS 方法已被用于多种样品基质的处理。相比于水果和蔬菜，本文涉及到的动物源食品样品需要在 d-SPE过程中采用 PSA 和 C18EC 去除这类样品中增加的蛋白质和脂类干扰。本文分析的兽药不需要使用 QuEChERS 缓冲盐，即原 AOAC或 EN QuEChERS 方法系用于萃取 pH 不稳定农药的盐。本方法由于其高选择性和高灵敏度，在分析复杂食品基质中痕量级的目标农药时非常耐用和快速。与固相萃取（SPE）相比，QuEChERS 方法会带来更多的基质干扰，因为它是一种“刚好够用”的样品制备技术。因此，需要高选择性的仪器，如使用带 DMRM 检测模式的 LC/MS/MS 对兽药进行简便准确的分析。采用本文描述的 LC/MS/MS 方法，动物源食品中的 36 种兽药可以在 9 min 内实现有效的分离。本法联用快速 QuEChERS 萃取，减少了大量操作步骤和分析人员的时间，为常规工作中兽药的筛查提供了一个可靠的方法。

实验部分试剂与标准品所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或者分析纯。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）购自 Honeywell 公司（马斯基根，密歇根州，美国）。甲酸（FA）和乙酸购自 Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

溶液和标准溶液将 1 mL 甲酸加入 100 mL ACN 中，混匀，制备 1% 甲酸 ACN 溶液，每天新鲜配制。将 1 mL 乙酸加入 100 mL ACN 中，混匀，制备 1% 乙酸 ACN 溶液，每天新鲜配制。标准溶液制备的浓度为 10 µg/mL（磺胺类和大环内酯类）、5 µg/mL（氯吡多）和 1 µg/mL（喹诺酮类）。仪器与材料配备二极管阵列检测器的 Agilent 1260 HPLC （安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国）。带有 AJST 电喷雾离子源的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统（安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国）。Agilent Bond Elut QuEChERS 硫酸镁（部件号 5982-8082）Agilent Bond Elut 氯化钠（部件号 5982-5750）Agilent Bond Elut PSA（部件号 5982-8382 或 5982-5753）Agilent Bond Elut C18EC（部件号 5982-1382 或 5982-5752）Agilent Bond Elut SAX（部件号 12213042）Agilent Bond Elut NH2（部件号 12213021）药物残留分析用 Agilent Bond Elut d-SPE（部件号 5982-4956）Agilent Bond Elut QuEChERS 不带缓冲盐萃取试剂盒（部件号5982-5550）Agilent ZORBAX Solvent Saver HD Eclipse Plus C18，3.0 ×100 mm，1.8 µm 色谱柱（部件号 959757-302）

样品制备样品匀浆空白的猪肉、牛奶、蜂蜜和鸡蛋样品购自当地一家杂货店。样品洗净并剁碎（视需要），然后于 -20 °C 保存。萃取取 2 克（±0.05 g）各样品（视需要匀浆），置于 50 mL 离心管中。向样品中加入 200 µL 兽药标准溶液，使浓度分别为 10 ng/g（磺胺类和大环内酯类）、5 ng/g （氯吡多）和 1 ng/g （喹诺酮类）。加入 4 mL 水，涡旋样品 1 min。每管中加入 10 mL1% 乙酸 ACN 溶液。盖上离心管并涡旋 1 min。 将萃取盐（4 gNa2SO4，1 g NaCl）加入各管中。样品管加盖并且剧烈振摇1 min。 在 4 °C 下以 5000 rpm 的速度离心 5 min，放置 30 min。分散 SPE取 6 mL 上层 ACN 相，转移至装有 50 mg PSA、150 mg C18EC和 900 mg 无水 Na2SO4的 15 mL 试管中。将试管盖紧，涡旋 1 min，然后以 5000 rpm 的速度离心 5 min。将 4 mL 上层 ACN 相转移至另一试管中，40 °C 下氮气吹干。用 1 mL ACN/H2O 溶液（2 : 8）复溶样品残渣，然后以 10000 rpm 的速度离心 10 min。将上层相溶液转移至自动进样瓶中。

结果与讨论色谱条件优化Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统在 600 bar 的最高压力下可快速获得质量的数据结果。结合使用 Eclipse Plus C18亚 2 µm 填料色谱柱，该分析系统可以改善分离度，缩短分析时间，提高检测灵敏度，这些改进对于兽药筛查都极为重要。Agilent6460 MS/MS 系统具有高检测灵敏度，先进的六极杆碰撞池可以消除背景噪音和交叉污染，并且创新的动态多反应监测（DMRM）方法在 LC 分离过程中即可根据每个分析物的保留时间窗建立离子对列表。基质标准溶液中 36 种兽药（磺胺类和大环内酯类 10 ng/g、氯吡多 5 ng/g 和喹诺酮类 1 ng/g）的 LC/MS/MS 分离状况见图 1。每种化合物的 MS 条件见表 1。

萃取和分散 SPE 参数的改进在初始评价阶段，我们使用安捷伦 Bond Elut 无缓冲盐和用于药物残留的 Bond Elut QuEChERS d-SPE 试剂盒。在方法开发期间，我们发现有必要改进操作步骤。这些改进可以使回收率满足常规分析的要求，详情如下所述。这个方法已成功应用于如下样品基质的处理：肉类、蜂蜜、蛋类和奶类。萃取步骤的优化首先，药物残留的 d-SPE 过程（150 mg C18，900 mg MgSO4）在方法1、2、3 和 4（表 2）中使用，以评价萃取步骤改进的效果。萃取盐包QuEChERS 方法使用 MgSO4 去除样品中的水分。实验表明，MgSO4 的使用对许多化合物的回收率有负面影响，尤其是磺胺类和大环内酯类药物。用 Na2SO4 替代 MgSO4，并且离心后将样品静置 30 min，可以有效地吸收水分 [2]。结果表明，用 Na2SO4替代 MgSO4，可以提高磺胺类和大环内酯类药物的回收率（表 2中的方法 1 和方法 2）。

萃取溶剂在萃取步骤中，还对水/乙腈的比例进行了评价。结果表明，萃取步骤中，采用比例为 1 : 2 的水/乙腈时，其回收率较比例为 1 : 1时的好（表 2 中的方法 2 和方法 3）。肉类基质的许多样品制备技术中常用酸去切断化合物-蛋白质的结合，这会直接影响其回收率。通常用于这种目的的酸是甲酸和乙酸 [3]。经比较表明，采用含 1% 乙酸的乙腈溶液处理样品的回收率大于采用含 1% 甲酸的乙腈溶液的处理效果。（表 2 中的方法 3和方法 4）。在四个方法的评价中，林可霉素的回收率都很低。推测是由于林可霉素具有强极性（log P = 0.56），限制了乙腈对它的萃取。

表 3 的结果表明，方法 1 和 5 实现了回收率，它们分别采用了添加或不添加 PSA 的 C18EC。我们的目的是可以找到一个适用于我们所有样品基质的 d-SPE 处理方法。因此，在 d-SPE 过程中使用 PSA 非常重要，因为它可以去除蜂蜜基质中普遍存在的有机酸和糖。 最终选择的 d-SPE 参数为 50 mg PSA、150 mgC18EC 和 900 mg Na2SO4。其它样品基质除了肉类基质，本方法也成功用于蛋类、奶类和蜂蜜基质样品的处理。这些基质样品的回收率良好，满足常规兽药定量分析要求（附录 I）。

结论采用改进的 QuEChERS 方法，结合使用 LC/MS/MS，可以成功实现省时的动物源基质样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多兽药的筛查。本文优化的最佳 QuEChERS 组成为：4 g Na2SO4、1 g NaCl 作为萃取盐，乙腈（1% 乙酸）作为萃取溶剂，d-SPE 过程中使用 50 mg PSA、150 mg C18EC 和 900 mg Na2SO4。改进的QuEChERS 方法回收率满足常规兽药筛查的要求。