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【Zeno SWATH DIA】结合微升液相提升可定量蛋白质的数量
随着定量蛋白质组学应用领域的不断发展，人们正在研究更大的生物队列，通常使用从生物样本库或其他来源难以获得的珍贵样本进行研究。这对工作流程提出了 2 个要求：更快的获取酶解样品的定量数据和使用更少量的样品。数据非依赖型采集 (DIA) 作为对蛋白质组样本中大量蛋白质进行可重复定量分析的优选工作流程，在这类研究中被广泛应用。
本研究优化和评估了微升液相与 Zeno SWATH DIA 组合的使用，并与传统SWATH DIA 进行比较。同时测试比较了四种不同的梯度长度（5、10、20 和 45 分钟）的鉴定结果，以满足一系列应用需求。
■ 样品准备：人 K562 细胞裂解产物，来自SWATH acquisition performance kit (SCIEX)。进样量范围为 12.5ng - 400 ng。
■ 液相方法： ACQUITY UPLC M--Class液相系统（Waters），分析色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，梯度：5min, 10min, 20min, 45min（表 1）。
表1.液相梯度洗脱参数
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■ 质谱方法：ZenoTOF 7600系统2台，采集模式：Zeno SWATH DIA，可变窗口采集，针对每个梯度长度优化使用40、60 或 80 个窗口和 MS/MS 累积时间（表 2）。在MS/MS 模式，分别开启Zeno trap（Zeno SWATH DIA 模式）和关闭 Zeno trap（SWATH DIA模式）参数下，样品平行采集三次。
表2. 优化的Zeno SWATH DIA方法参数
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■ 数据处理：Zeno SWATH DIA数据使用DIA-NN[1]软件处理，使用数据库流程，数据库为之前由OneOmics™软件包中ProteinPilot™软件搜库构建的样本谱图库。
主要结果
1. Zeno SWATH DIA在低样品量时的增益倍数评估
Zeno SWATH DIA和SWATH DIA 的进样量曲线由DIA-NN 软件处理得到，以确定可重复定量分析的蛋白质和肽段的数量。图 1 显示在 2 套 ZenoTOF™ 7600 系统上， 45 min液相梯度，每个进样量在 SWATH DIA 和 Zeno SWATH DIA 模式得到的数据。正如预期，Zeno SWATH DIA模式下，随着进样量的增加，可定量蛋白质数量随之增加。K562 400 ng 进样量 ，在45 min液相梯度下，平均鉴定蛋白质约 6200 个，其中可定量蛋白质约 5,600 个（CV < 20%）。
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图1. 开启和关闭Zeno trap模式下，45 min梯度的
蛋白质定量和肽段定量的数量与进样量的关系曲线
注：左图为蛋白质，右图为肽段
当固定进样量时，相比于 SWATH DIA，Zeno SWATH DIA可定量的蛋白质和肽段数量大幅增加。在低进样量条件下，蛋白质和肽段鉴定水平提升更高（图 2）。
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图2. Zeno SWATH IDA模式定量蛋白质
和肽段数量的增益倍数
注：圆形表示定量蛋白质的数量，钻石表示定量肽段的数量
2. 快速液相梯度结果评估
通过测试 4 个 液相梯度长度。绘制进样量曲线以评估不同的液相梯度对定量蛋白质数量的影响并确定实验的最佳进样量（图 3）。结果表明，对于5 min和 10 min较短的液相梯度，最佳进样量约 100 ng 。对于20 min和 45 min较长的梯度，最佳进样量约200-400 ng。
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图3. 不同液相梯度长度进样量曲线对比
随着微升梯度时间的缩短，鉴定和定量的蛋白质数量减少。但在相同进样量下， 20 min梯度定量的蛋白质数量几乎与45 min梯度一样多。结果表明，20 min长度梯度是采集参数的最佳色谱方案（300 μm ID 分析色谱柱，5 μL/min），因其实现了峰形与肽段分离之间的平衡。对于样本为少量的细胞酶解产物，优选分析较快的梯度，在进样量为 12.5 ng - 50 ng时，10 min梯度可获得合适的蛋白质覆盖率和良好的样品通量。
使用 20 min液相梯度的 Zeno SWATH DIA 数据，通过绘制蛋白质定量CV%分布图展示数据集中整体定量蛋白质的方差分布（图4）。结果显示，进样量越低，蛋白质定量方差越大。
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图4. 20 min液相梯度时蛋白质定量方差分布图
文献：
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.
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