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空间脂质组学—激光显微切割质谱联用技术助力脑组织微区研究

2022年08月09日 16:51 来源:SCIEX

大脑是结构最复杂的器官之一,主要功能与其微区的分子相互作用密切相关。不同代谢物在不同部位有特征性表达。传统分析技术受样品制备分辨率以及分析灵敏度的限制,无法精准获取靶向微区部位,而对其中特异微区代谢物的差异表达分析就更加困难。


在微区样品在制备过程中面临的一个主要问题就是如何在尽量避免或减少对细胞代谢的影响,其中一种方法就是在制备过程中将细胞尽可能地维持在天然环境中。组织切片伴随着显微镜技术等的发展而得到广泛的应用,而激光显微切割 (LMD, Laser Microdissection)技术可以方便地对特定的组织区域的精确分离(图1)


图1. 徕卡激光捕获显微切割采用移动激光的显微切割技术。徕卡显微系统采用高精确度的光学部件并借助棱镜沿着组织上所需的切割线对激光束进行操纵,可垂直于组织实施切割,从而获得切割精确、无污染的分离体。



相比DNA和RNA,细胞内的代谢物无法扩增,组织微区内提供的用于分析的代谢物浓度低体积小,一些极为稀少的代谢物需要更加灵敏的检测方法。在继承以往产品耐用性的同时,SCIEX 7500系统灵敏度的提高可以应对诸如脑组织微区代谢组学这些非常具有挑战性的分析工作。

脑组织微区样品制备
由制备好的脑组织切片样本置于激光显微切割载物台,确定好焦距平面后,将视野移动到空白区域,进行激光切割位置校准,再将视野移动到待切割的细胞区域;选择合适的切割区域 (实验中切割面积为约2000 µm2),在调节好相关参数后开始进行切割(图2)。


图2. 脑组织切片样本用于激光显微切割分离体制备。在40倍放大视野中选取合适的面积,约2000 µm2(左)进行切割分离并用于后续分析;一份样品切割分离完成后(右),可继续选择其他区域进行操作。


高覆盖靶向脂质组学分析

该方法提供了众多的多反应监测(Multiple reactions monitoring, MRM)离子对用于多种脂类物质的靶向检测。化合物列表中可以检测约1900种脂质分子,可以充分覆盖哺乳动物的血浆、组织和细胞中的常见脂质。另外,针对特定的待测物质,也可直接在MRM列表中添加其它想要检测分析的脂质化合物离子对。在分离的微量细胞中共检测到285个脂质化合物,包括鞘脂SM、胆固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰胆碱PC、神经酰胺Cer7类(图3)。

图3. 脑组织微区中测得的不同种类脂质化合物的数量。基于LC-MS/MS的靶向脂质组学方法快速分析基质中的多种脂类物质。



对于痕量细胞中检测到的脂质化合物的判定,基于与空白提取溶剂(阴性对照)和血浆脂质提取样本(阳性对照)共同比较,并且结合各类脂质标准品出峰位置情况、同类脂质化合物有较为接近的出峰位置,而同类脂质化合物连接脂肪酸链越长保留时间越靠后、连接相同碳数的脂肪酸链上不饱和键数越多保留时间越靠前的规律,对微量样本中检出的脂质化合物做定性判断(图4)。

图4. 微量脑组织切片中测得的脂质化合物示例图。通过LC-MS/MS测得的7类脂质化合物在空白提取溶剂中(左)均不存在,而与阳性对照血浆样本(右)中出峰行为一致。



通过徕卡激光切割显微镜LMD7精确获取微量样本技术与SCIEX 7500系统高灵敏度检测相结合,实现从空间形态到微量细胞高覆盖靶向脂质组学分析检测。在约2000 µm2 组织切片样品中检测到脂质化合物数目285个,符合组学分析对化合物覆盖度的需求。



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