文献速递丨SFC-MS/MS法同时测定血清中多种维生素D代谢物（下）

上期回顾

中国疾病预防控制中心营养与健康研究所、宁波大学食品与药学院中国食品科学与技术系、岛津企业管理(中国)有限公司联合研究，成功建立并验证了适用于血清中多种维生素D代谢物的高通量、高灵敏度SFC-MS/MS分析方法。

上期介绍了研发背景及如何建立并优化色谱条件等研究内容。

本期将介绍对已建立的SFC-MS/MS方法进行验证 、并与LC-MS/MS法比较等研究成果。

文章出处

Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23

岛津Nexera UC全相系统之SFC-MS系统

本研究采用岛津超临界流体色谱仪Nexera UC、岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8060

● 超临界流体与改性剂配合使用，可在更大范围内满足不同极性化合物的检测需要；

● 低死体积和背压控制单元有效降低脉动，提高灵敏度；

● 溶剂使用量少且分析时间短，是一种绿色环保、高效的分析手段。

SFC-MS/MS方法验证

验证项目有：拖尾因子(TF)、保留时间RSD、峰面积RSD、标准曲线线性、检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

表1 SFC-MS/MS的方法验证结果

此外，还对准确度和精密度进行了评估。如表2所示，QC和NIST样品的准确度均＜5.5%。日内和日间精密度的RSD值分别在0.52-7.93%和1.35-9.04%之间，表明SFC-MS/MS性能偏差在可接受范围内。

表2 QC和NIST样品的准确度和精密度（日内和日间）

SFC-MS/MS法与LC-MS/MS法的比较

将验证过的SFC-MS/MS方法与同一色谱柱内部开发的参考LC-MS/MS方法进行比较。SFC在10 min内实现分析物的基线分离，而LC系统则需要16分钟以上才能实现等质量的分析物的相似分离度。此外，与LC-MS/MS相比，SFC-MS/MS具有更低信噪比获得较低的LOQ。

表3 比较SFC-MS/MS和LC-MS/MS法对VD代谢物的保留时间、信噪比(S/N)、定量限(LOQ)和峰分离度(USP)的影响。

为考察SFC-MS/MS法对实际样品分析的准确度，对46份未加标的人血清样品进行分析，以评估该法与LC-MS/MS方法相比的潜在偏差。如图1，SFC-MS/MS法与LC-MS/MS法回归相关性显著，VD₂/VD₃、25-OH VD₂/VD₃、3-epi-25-OH VD₂/VD₃和24,25-(OH)₂ VD₃分别为R2≥0.98和P≤0.001。Bland-Altman图表明，两种方法之间不存在浓度依赖的差异。方法间的测量值对LC-MS/MS测量值的平均差异偏差为-0.9% ~ 2.7%。

图1. SFC-MS/MS和LC-MS/MS方法的回归分析和Bland-Altman

结论

本研究开发并验证了SFC-MS/MS方法作为同时测定人血清中VD代谢物的替代方法。不同VD代谢物在SFC和LC体系中洗脱能力也有差异。并且SFC有效改善等质量分析物的分离，比LC具有更短的保留时间和更高的灵敏度。与反相LC相比，超临界CO2更环保，有机溶剂消耗更少。因此，采用SFCMS/MS方法可以在高通量的情况下对VD代谢产物进行准确、精确的分析。建立的SFC-MS/MS方法与参考的LC-MS/MS方法对人血清中VD代谢物ng/mL水平的定量一致，两种方法之间不存在浓度依赖性差异。然而，对于痕量(pg/mL)的VD代谢物，如1,25-(OH) VD2/VD3，还需要未来开发出更高灵敏度的质谱仪来分析。

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