文献速递| SFC-MS/MS法同时测定血清中多种维生素D代谢物（上）

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引言

中国疾病预防控制中心营养与健康研究所、宁波大学食品与药学院中国食品科学与技术系、岛津企业管理(中国)有限公司联合研究，成功建立并验证了适用于血清中多种维生素D代谢物的高通量、高灵敏度SFC-MS/MS分析方法。

由于研究内容较多，故分为上、下两期来进行详细介绍。本期主要介绍内容为：研发背景、样品前处理、如何建立及优化SFC-MS方法等。

文章出处

Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23

岛津Nexera UC全相系统之SFC-MS系统

本研究采用岛津超临界流体色谱仪Nexera UC、岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8060

● 超临界流体与改性剂配合使用，可在更大范围内满足不同极性化合物的检测需要；

● 低死体积和背压控制单元有效降低脉动，提高灵敏度；

● 溶剂使用量少且分析时间短，是一种绿色环保、高效的分析手段。

研究背景

维生素D（VD）作为一种脂溶性类固醇，在钙稳态和骨骼健康中起着重要作用，其主要以麦角钙化醇（VD₂）和胆钙化醇（VD3）两种形式存在，多通过皮肤光照和食物或膳食补充剂来获取。VD进入体内参与生物调控，须在肝脏及肾脏内进行羟基化等复杂的代谢途径反应，因此其代谢产物结果是VD临床评价的主要挑战之一。

对于正常人血清或血浆中含有痕量1,25-(OH)₂ VD₂和1,25-(OH)₂ VD₃，分析时应考虑进一步改进定量限(如衍生化)。与LC-MS/MS法相比，采用超临界流体色谱仪（SFC）作为质谱前端，不仅降低了有机溶剂成本，还有具有更快分析速度及更高灵敏度。

样品前处理

采用3.5 mL真空血管采集空腹血样，凝固后1500 ×g离心30 min。上层血清移入无菌管，-80℃保存后用于分析。 

建立及优化SFC-MS分析方法

1. SFC色谱柱的选择

考察了10种VD代谢物分别在Diol、CN、NH2、PFP和C18 5根色谱柱上的洗脱性能，并评价了不同固定相的选择性。如图1，除C18柱外，其他4根色谱柱上VD代谢产物色谱峰均为正常的洗脱顺序，保留时间随羟基数量的增加而增加。其中PFP柱能够分离所有VD代谢产物，分离效果最佳，特别是25-OH VD2/VD3及其对映体的分离，并被选择用于进一步开发。

图1：A) Diol, B) CN, C) NH₂, D) PFP, E) C18色谱柱上VD代谢产物的固定相化学结构和洗脱顺序。

1: 25-OH VD₃和3-epi-25-OH VD₃;

2: 25-OH VD₂和3-epi-25-OH VD₂;

3: VD_3;

4: VD₂;

5: 1,25-(OH)₂ VD₃;

6: 1,25-(OH)₂ VD₂;

7: 24，25-(OH)₂ VD₃;

8: 24，25-(OH)₂ VD₂。

2. 梯度洗脱条件优化

纯CO₂是VD代谢物的弱洗脱溶剂，与固定相相互作用强。因此，为提高流动相的洗脱强度，加入甲醇作为改性剂。图2显示了四种不同梯度下VD代谢物的分离情况。

在Gradient 4条件下，二羟基代谢物的峰形明显改善，这可能是由于甲醇比例的急剧增加(1.5 min内从8%增加到40%)改善分离效果，由此减少二羟基代谢物的扩散。因此，选择Gradient 4进行进一步优化。

图2：四种梯度洗脱程序(流动相A: CO2;流动相B:甲醇，色谱柱：PFP)

虚线(-)：流动相B的百分比；USP：分离度。(1-8序号对应VD代谢物名称同图1)

3. 流速的选择

虽然超临界流体黏度较低，但扩散系数较高。因此，在柱前压力和洗脱液密度较高，设定较高流速时，梯度有望提高峰之间分离度。图3(A)为不同流速下VD代谢物的洗脱。当流速从1.0 mL/min增加到1.5 mL/min时，25-OH VD2/ VD3及其表异构体的分离明显改善，但当流速增加到2.0 mL/min时，分离度降低。因此后续研究设定流速为1.5 mL/min。

4. 柱温的选择

色谱柱温度影响流动相粘度和界面分布。如图3(B)所示，温度从30℃升高到40℃，25-OH VD2/VD3及其同位异构体的分离得到改善，但温度再升高到50℃，分离效果较差。因此后续研究采用柱温40℃。

图3  A）流速和B）温度对PFP柱上VD代谢物分离的影响。

5. MS系统优化

为提高VD代谢物的电离效率，对离子源类型和补偿剂缓冲液浓度进行了优化。对于离子源的选择，测试了电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)，两者都是在正离子模式下。如表1，浓度为1 ng/mL的所有VD代谢物，ESI+模式下的信噪比(S/N)比APCI+模式下的高4~6倍。因此, 在ESI+模式下评估不同浓度缓冲液，当甲酸铵浓度从1 mM增加到5 mM, S/N较好；将甲酸浓度从0.5‰(v/v)提高到1% (v/v)可进一步优化灵敏度，但甲酸浓度为2‰ (v/v)则没有进一步提高灵敏度。因此，采用ESI+进行电离，选择5 mM甲酸铵和1‰ (v/v)甲酸作为补偿剂。

表1 离子源类型和缓冲液对维生素D代谢物信噪比(S/N)的影响(1 ng/mL)

FA: 甲酸;  AmFc: 甲酸铵

本期小结

本研究建立了适用于血清中多种维生素D代谢物的SFC-MS方法，并通过优化分析条件，确定最佳分析条件为：PFP色谱柱、梯度程序4、流速1.5mL/min、柱温40℃，离子源类型为ESI+，补偿剂为 5 mM甲酸铵和1‰ (v/v)甲酸。基于此分析条件下，可实现PFP柱可在10 min内10种VD代谢物的基线分离;在正电喷雾电离模式下进行检测，允许对血清基质中的多种VD代谢物进行定量分析。

下一期将介绍方法验证 、 SFC-MS/MS法与LC-MS/MS法的方法比较，敬请期待！

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