三重四极液质联用仪分析全血中的环孢素 A、依维莫司、西罗莫司

摘要本研究建立了一种高灵敏度、高特异性的分析方法，用于定量分析一组环孢素 A (CsA)、依维莫司 (Eve)、西罗莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac)。该方法运行时间为 2 分钟，适于同时定量分析全血中的所有四种分析物。

前言本应用简报介绍了一种采用 Agilent 1260 液相色谱系统结合配置了安捷伦喷射流技术的Agilent 6460 三重四极杆质谱仪，灵敏而准确地检测全血中四种免疫抑制药物，环孢素A (CsA)、依维莫司 (Eve)、西罗莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac) 的分析方法。采用串联质谱仪 (MS/MS) 和多反应监测 (MRM) 技术，该方法中 CsA 的线性范围为 1.95 ng/mL 到2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 的线性范围为0.10 ng/mL 到 100 ng/mL。

实验部分试剂和标样为开发分析方法，除环孢素 A-d4 和未标记的依维莫司分别购于多伦多研究化学品公司和 Sigma-Aldrich 公司外，所有未标记和标记的标准品均购于 Cerilliant 公司。所有标准品均保存在 -20 °C 环境下。使用氘代模拟内标物 (ISTD) 以确保准确定量。分析物及其对应的内标物在表 1 中列出。所有其他LC/MS 级溶剂和试剂均购于 Sigma-Aldrich和 Honeywell 公司。经认证的健康全血购于当地的一家血库。此外，使用了来自 ChromSystems 的校准品和来自 BioRad 的质控品 (QC)，以评估该方法的准确度和精密度（表 9）。为测定线性度，将标准品加入全血中得到高浓度校准标样，CsA 为 2000 ng/mL，Eve、Sir 和 Tac 每种为 100 ng/mL。然后用全血进行两倍连续稀释，以获取剩余标准曲线浓度。线性分析中用到的分析物浓度在表 2 中列出。

样品前处理所有校准品、质控品和样品都采用一种简单的蛋白沉淀程序进行前处理：1. 将 100 µL 的全血与 200 µL 含有内标的沉淀试剂（0.4 M 硫酸锌:甲醇为 1:4）混合2. 涡旋 30 s3. 以 10000 rpm 的转速离心 4 分钟4. 将上清液转移至自动进样器样品瓶中，并使用 LC/MS/MS 分析液相色谱配置和条件使用 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统进行分析。该系统包括：• Agilent 1260 Infinity 二元泵 (×2)• 带 2 位/6 通色谱柱切换阀的 Agilent1260 Infinity 柱温箱• Agient 1260 恒温自动进样器为提高仪器的稳定性，也推荐在自动进样器针座和进样阀之间使用在线过滤器（部件号5067-1551）。液相色谱条件在表 3、4、5 和表 6 中列出。

自动化在线样品净化本方法所用的 HPLC 采用两个二元泵以实现自动化样品净化（图 2）。样品上样到捕集柱，分析物保留在柱内，然后使用第一个泵进行了冲洗。冲洗液流入废液容器，减少了进入质谱仪的基质量。在分析物即将从捕集柱中洗脱时切换阀头，使洗脱的分析物进入分析柱，然后通过第二个二元泵进行进一步色谱分离。

质谱条件采用使用了喷射流技术的 Agilent 6460 三重四极杆质谱进行分析。*的 MRM 转换离子对保证了对每种分析物定量分析的特异性。内标物 (ISTD) 的使用减少了因样品前处理过程中分析物损失或者因样品基质差异而造成的误差。质谱条件和 MRM 转换离子对在表 7 和表 8 中列出。

使用市售校准品 (ChromSystems) 和质控品(BioRad) 进行了日间进样以评估该方法的准确度和稳定性。数据由 4 名不同的操作人员在 14 天的时间内取得。每个浓度质控品的实测准确度在表 9 中列出。

结论本研究使用 Agilent 6460 三重四极杆LC/MS/MS 系统开发了一种高通量、运行时间为 2 分钟的分析方法，用于免疫抑制剂环孢素 A、依维莫司、西罗莫司以及他克莫司的定量分析。经过简单的蛋白沉淀后，进行自动化在线样品净化，最大限度地减少了血液中生物化合物造成的基质效应和离子抑制。采用这种方法实现了全血基质中所有四种分析物可靠且快速的定量分析。所有分析物经证实在所需的范围内都具有良好的线性。