三重四极杆质谱仪同时高灵敏度测定酒中的多种真菌毒素

 摘要：本文开发了一种可同时测定葡萄酒中八种真菌毒素的方法，包括黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2、展青霉素、呕吐毒素、赭曲霉毒素 A 以及 玉米赤霉烯酮。在氯化钠和硫酸镁存在的条件下，采用乙腈对样品进行初步提取。采用旋转蒸发法对得到的提取物进行浓缩，然后进行复溶，再利用超高效液相色谱 (UHPLC) 三重四极杆质谱多反应模式 (MRM)检测。结果表明在红葡萄酒和白葡萄酒中八种真菌毒素的检测限 (LOD) 分别在 0.050 至3.3 µg/L 和 0.030 至 8.0 µg/L 范围内，定量限 (LOQ) 分别介于 0.15 至 2.5 µg/L 和 0.10至 25 µg/L 范围内。对于全部八种真菌毒素，在选定的两个数量级的基质匹配校准范围内线性响应良好，线性回归系数为 0.995 或更高。对于所测定的两个加标水平，回收率介于 59.6–132.4%，精密度 (RSD) 介于 1.2–21.1% (n = 6)。其中，大部分加标样品的回收率为 70%–120%，RSD 小于 10%。本文开发的方法快速、准确、灵敏，可用于葡萄酒中多种真菌毒素的高通量常规筛查，并可能扩展到其它发酵酒类样品的应用中。

前言真菌毒素是由各种真菌在适宜的气候条件下自我复制而生成的一系列次级代谢产物。已见诸报道的真菌毒素有 300 余种。研究表明一些真菌毒素会导致多种不良健康效应，包括抑制免疫系统，诱发癌症及畸形，干扰生长发育，等等 [1,2]。用于酿酒的农产品（例如葡萄）在生长、储存和加工过程中易感染真菌，进而受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素 A (OTA) 是葡萄酒中最常见的一种真菌毒素 [3-5]。欧盟 (EU) 规定酒中 OTA 的最高*为 2 µg/L。事实上许多其它的真菌毒素也可能存在于酿造完成的酒中，例如黄曲霉毒素（B1、B2、G1 和 G2），呕吐毒素 (DON)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、展青霉素 (PAT) [6,7]。一些国家和国际组织已经规定了大多数原始农产品中这类真菌霉素的最高*。但是，这些真菌毒素在酒中的*至今并没有得到太大的关注。不同于其它食物商品，酒是一种特殊的饮品，其主要成分为酒精。与真菌毒素自身对人体健康的影响相比，在饮酒的同时摄入真菌毒素可能会加重影响。一篇近期的报道指出，小鼠同时摄入黄曲霉毒素 B1（一种致癌的真菌毒素）及乙醇表现出加合效应，会显著加重对其肝脏的氧化损伤 [8]。与其它食品相比，人体对酒中某些真菌毒素的耐受性可能较低，因此，需要建立一种灵敏可靠的方法对酒中的潜在真菌毒素进行常规筛查，以确保消费者的安全。对酒中的潜在真菌毒素进行常规筛查以确保安全性。高效液相色谱电喷雾串联质谱法 (HPLC-ESI-MS/MS)，结合多种预提取技术，已广泛应用于检测玉米、饲料、牛奶及草药等基质中的真菌毒素 [9-14]。但是，极少有报道关注葡萄酒中的多种真菌毒素 [15]。本应用简报基于 UHPLC-ESI-MS/MS 技术，展示了一种用于快速有效检测葡萄酒中潜在八种真菌毒素的高通量检测方法。

实验部分试剂、化学品和样品八种真菌毒素包括展青毒素 (PAT)、呕吐毒素 (DON)、黄曲霉毒素G1 (AFG1)、黄曲霉毒素 G2 (AFG2)、黄曲霉毒素 B1 (AFB1)、黄曲霉毒素 B2 (AFB2)、赭曲霉毒素 (OTA) 以及玉米赤霉烯酮 (ZEN)（纯度大于等于 99%）均购自 Romer 实验室（澳地利）。甲酸和乙酸铵分别购自美国天地及赛默飞世尔科技公司。红葡萄酒和白葡萄酒均为进口葡萄酒，从当地进口商处随机选择。真菌毒素化合物的标准溶液制备采用纯甲醇配制，储备溶液浓度为 10 µg/mL，于 –18 °C 下储存。利用甲醇/水（20:80，体积比）将其稀释至适当浓度用于校正。样品前处理准确量取葡萄酒样品 2.5 mL 于离心管中,加入 20 mL 纯乙腈 (ACN)混合。然后向离心管中加入氯化钠 (2 g) 及硫酸镁 (0.25 g)。对所得混合物涡旋振荡 3 min 后，在 8000 rpm 下离心 10 min。将占原始体积 80% 的上清液转移至干净的鸡心瓶中，40 °C 下旋转蒸发至近干。残渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，体积比）复溶，并用0.22 µm 膜过滤后，进行 UHPLC-ESI-MS/MS 分析。为了检验是否需要进一步净化，这里分别尝试了 C18、PSA 和石墨化炭黑 (GCB) 对提取液进行净化。乙腈提取后所得的上清液均分为三等份加入离心管中，分别与 C18、PSA 和 GCB 混合，持续振荡 10 min。将混合物在 8000 rpm 下离心 10 min，所得的上清液采用旋转蒸发进一步浓缩。所得残渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，体积比）复溶，并用 0.22 µm 膜过滤后，进行 UHPLC-ESI-MS/MS分析。使用真菌毒素的回收率评估净化效率。

基质效应评价为了验证红葡萄酒或白葡萄酒基质是否会影响这些真菌毒素检测的准确度，根据样品前处理步骤向葡萄酒中加入一定量的真菌毒素。采用 UHPLC-ESI-MS/MS 分析所得到的样品。比较每种分析物与相同水平标准溶液中真菌毒素的峰面积。与标准溶液相比，加标基质样品中峰面积比例的降低或增加分别代表基质抑制或增强的程度。基质匹配的线性校正、检测限及定量限为了评估线性及检测灵敏度，选用事先确定无检测目标分析物的空白基质。同样品一样，对空白基质进行提取和浓缩。所得残渣使用一系列溶于甲醇/水（20:80，体积比）的真菌毒素标准溶液进行复溶。基质匹配的标准溶液用 0.22 µm 膜过滤后，进行UHPLC-ESI-MS/MS 分析。对每种分析物的峰面积及其浓度进行相关分析以验证线性。利用基质匹配校准标样的低浓度样品生成的S/N，计算所开发方法的检出限 (S/N= 3) 及定量限 (S/N = 10)。准确度和精度为了验证方法的准确度和精密度，向空白基质中加入两个水平的各种真菌毒素作为加标样品，重复分析六次。由于葡萄酒、葡萄或其它可参考农产品中每种真菌毒素所规定的*水平相差很大，且每种真菌毒素的质谱灵敏度相差也很大，因此将中国法规中现行最高*水平及其四分之一水平作为每个分析物的加标水平。加标样品前处理同样品前处理过程相同，并采用 UHPLC-ESI-MS/MS进行分析。使用六次重复测定的平均回收率和相对标准偏差评估方法的准确度和精密度。‘

UHPLC-MS/MS 条件整个研究过程中均采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系统。其包括 1290 Infinity 二元泵、自动进样器和柱温箱。采用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）进行八种真菌毒素的分离。流动相是溶液 A 和溶液 B 的在线混合物，其中 A 为纯水，B 为含有 5 mmol/L 乙酸铵的甲醇。初始梯度为 10% B，0–2.4 min 内线性增加至 42% B，然后在 2.4–6 min内持续增加至 51% B。接着在 6.0–6.2 min 内，% B 快速增加至90%，保持 2 min 以确保所有分析物和干扰物质可从色谱柱中洗脱出来。流速为 0.4 mL/min，进样量为 5 µL，柱温为 40 °C。两次连续分析间的柱平衡时间设置为 1 min。UHPLC 系统的洗脱液由射流电喷雾 (JetStream ESI) 离子源直接进入 Agilent 6460 三重四极杆 MS/MS 系统，并在多反应监测模式 (MRM) 下进行检测。正 (pos) 和负 (neg) 模式下的一般离子源参数如下：毛细管电压，3500 V (pos)，2000 V (neg)；喷嘴电压，500 V (pos)，1900 V (neg)；干燥气温度，325 °C；干燥气流速，6 L/min；雾化气压力，45 psi；鞘气温度，350 °C；鞘气流速，11 L/min。针对每种化合物优化毛细管出口电压和碰撞能量。

结果与讨论离子模式的选择及多反应监测参数的优化在所研究的八种真菌毒素（图 1）中，PAT、DON、OTA 和 ZEN含有羟基、酚羟基或羰基配体，较易在 ESI 过程中丢失质子，因此需要在负离子模式下进行分析以获取高灵敏度。相反，黄曲霉毒素含有羰基和甲氧基配体，较易在 ESI 过程中获得质子，因此在正离子模式下分析可以获取较高的灵敏度。在所选择的离子模式下，利用 6460 三重四极杆 MS/MS 系统分别分析溶于 20% 甲醇水溶液的各种真菌毒素。采用人工或优化软件优化每个 MRM 离子对的毛细管出口电压 (fragmentaor voltage)和碰撞能量 (collision enegy)。毛细管出口电压由 70 V 扫描至200 V，选择最高质谱响应时的电压作为优化值，并用于进一步的碰撞能量选择。然后利用一系列碰撞能量（CE 由 5 V 至 50 V）裂解分析物。选择可获得最高强度和第二高强度碎片的碰撞能量分别作为定量和定性 MRM 离子对的优化碰撞能量。优化后的参数列于表 1。

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