气质联用系统对美国产赤霞珠葡萄酒进行挥发物分析

摘要：本实验以 Agilent 5975 系列 GC/MSD 系统为基础，使用选择性离子监测 (SIM)/SCAN数据同步采集检测模式测定葡萄酒中的 61 种挥发性化合物，开发出一种半定量的自动化顶空固相微萃取 (HS-SPME) 气相色谱/质谱 (GC/MS) 方法。通过此方法对美国市售的24 种赤霞珠干红葡萄酒和混酿葡萄酒进行了分析。将葡萄酒分析结果与描述性的感官评定相对比，开发一种快速的靶向分析方法，使其能够对一些芳香性感官特性进行预测。此项工作可帮助美国葡萄酒行业定义现有的赤霞珠葡萄酒风格，并确定需要进一步市场开发的区域。

前言目前，人们对于采用化学分析方法研究葡萄酒感官特性的做法越来越感兴趣。飞行时间 (TOF) 质谱联用综合型气相色谱后，可分析成千上万种化合物。但是，并非所有的化合物都会对葡萄酒的感官特性产生必然影响，还需进行强大而复杂的统计分析，将这些复杂的化学组分与表现出的感官特性联系起来。对特定化合物的靶向分析可以为评估葡萄酒中各种挥发性化合物提供一种快速的替代方法，将这些化合物与感官描述语相关联。在单四极杆质量选择检测器 (MSD) 上采用 SIM/SCAN 数据同步采集不仅可以快速获得用于分析物确证的全扫描谱图，还可对目标化合物进行高灵敏度、高选择性的定量和检测。本应用简报将介绍一项已发表的研究，该研究使用 HS-SPME 和5975 系列 GC/MSD 系统成功开发出一种针对美国赤霞珠葡萄酒和混酿葡萄酒的分析方法，可以对葡萄酒的多项重要感官描述语进行预测 [1]。以前曾有报道将 SIM/SCAN 数据同步采集用于分析葡萄酒的挥发物 [2,3]，但将 SIM/SCAN 数据同步采集用于鉴定可能使葡萄酒产生芳香气味的挥发性化合物，这还是第一次。实验最终从不同葡萄酒中一共鉴定出 55 种截然不同的挥发性有机物。统计分析将这些化合物与 7 种香气和 12 种味道和口感特性进行关联，不同葡萄酒所得分析结果也截然不同。

实验部分葡萄酒研究所用的全部葡萄酒均购买自市场，且产自美国本土。研究共采用 24 种赤霞珠干红葡萄酒和混酿葡萄酒（至少含有 56% 的赤霞珠），其中 19 种来自加州，5 种来自华盛顿。标样根据以前的报道 [4,5]，本研究共涵盖 61 种目标化合物。这些化合物中，有 58 种由参比化合物分析进行确证，见之前的文献报道[1]。将被测化合物的保留时间和谱图与认证标样进行匹配。仪器此分析方法采用 Agilent 5975 系列 GC/MSD 系统联用 Agilent6890 GC（配置有 Gerstel MPS2 自动进样器）开发而得。气相色谱和质谱的运行条件见表 1。SIM 参数中所用的离子和每个化合物的保留时间可参见上文所述的已出版研究文献 [1]。实验还使用与文献相同的气相色谱、色谱柱和自动进样器（联用 Agilent7000B 三重四极杆气质联用系统）对 2-异丁基-3-甲氧基吡嗪(MIBP) 进行了分析 [1]。样品前处理将葡萄酒样品（10 mL，未经稀释）移取到 20 mL 圆底棕色玻璃顶空瓶中，每个顶空瓶中装有 3 g (± 0.02) NaCl。迅速将顶空样品瓶放入仪器，进行分析。使用 2 cm 二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲硅氧烷（DVB/CAR/PDMS，Supelco），23号 SPME 纤维头进行采样。将样品置于 30 °C 条件下温热，以 500 rpm 的速度搅拌 5 min，再插入纤维头，在 30 °C 下以 250 rpm 的速度搅拌30 min。所有样品平行 3 份按随机的顺序，载入仪器后在 18 个小时内完成分析。

感官评定所有葡萄酒都按随机均衡的原则排列，每种一式三份，接受 11 位经过事先筛选和培训（如文献所述 [1]）的感官评审员的评审。最终，评估了 20 种香气特性和 14 种味道和口感特性。每种特性的程度由一条以“低”和“高”进行标记的 15 cm 的非结构化直线标度进行评估，少数特性除外，这部分特性采用其他相反的形容词对进行描述。

数据分析对于半定量靶性分析方法，采用相对于内标物（2-十一酮）的提取离子峰面积对色谱峰进行定量。使用 GC/MS/MS 测定 MIBP时，实验采用标准曲线，由 MIBP 相对于内标物 (2H3MIBP) 的相对响应计算 MIBP 的绝对浓度。

本实验采用方差分析法 (ANOVA) 对化学数据进行分析，通过伪混合模型测试确定葡萄酒和重复数对实验的影响，以均方差（葡萄酒*重复数）作为误差。对于感官描述语分析，实验采用伪混合模型测试对葡萄酒、重复数以及评审员的影响进行双因素方差分析，以包含葡萄酒的交互作用项的均方差作为误差。通过多个两两相关分析和偏最小二乘回归 (PLSR) 分析建立化学性质与感官数据之间的关系，通过 PLS2 将化学数据设为 x 变量（预测变量），感官描述数据设为 y 变量 [1]。使用单个的感官特性（y 变量）和化学数据（x 变量）进一步生成 PLS1 模型系列。

‍结果与讨论关联化学和感官数据采用偏最小二乘回归法 (PLSR) 对研究中涉及的 24 种赤霞珠葡萄酒和混酿葡萄酒的标准化重要化学和感官数据进行分析 [1]，结果见图 1。前两个主成分 (PC) 对化学数据（x 变量）和感官数据（y 变量）的贡献分别占 38% 和 46%。第三个主成分对化学和感官数据的贡献分别为 7% 和 10%（数据未示出）。本模型通过改良型气相色谱方法对赤霞珠葡萄酒和混酿葡萄酒中的 56 种化合物进行了测定，其中有 36 种对感官特性 (PLS2) 有显著 (p < 0.05) 影响，如这些化合物在图 1A 中相对于曲线的位置所示。为了更深层地探索化合物与感官特性之间的关系，我们对每个感官特性又进行了 PLS1 回归分析。化学组分与香气所测得的挥发性化合物可能会与很多感官描述语有关例如，二乙酰和乙偶姻均会产生奶油糖果的香气（图 1A）。这两种化合物会使食品和葡萄酒具有黄油的味道。已知化合物 4-乙基苯酚与 4-乙基愈创木酚会使葡萄酒产生类似于皮革或马鞍的味道，它们与本研究涉及的 a-柏木烯一起，会释放出稗草的气味（图 1A）。2-异丁基-3-甲氧基吡嗪 (MIBP) 具有柿子椒的气味，与植物香气呈正相关。PLS2 分析显示（图 1A），多种酯类（如，乙酸己酯和 2-苯基乙酸乙酯）、萜烯类（如，芳樟醇和 b-香茅醇）以及降异戊二烯化合物（如，b-突厥烯酮和 a-紫罗兰酮）均和浆果及鲜果香气有关。

化合物与味道和口感相关本研究发现大量的挥发性化合物与味道和口感相关（图 1，表 3），但这只代表它们之间存在相关性而非因果关系。计分图（图 1B）中的赤霞珠干红葡萄酒和混酿葡萄酒采用代码按所测酒精浓度从低 (W1 = 12.4% v/v) 到最高 (W24 = 15.9% v/v) 的顺序进行标识。模型中葡萄酒的主要差异为酒精浓度的不同（图 1B），这说明酒精浓度可能会间接地区分载荷图中的化合物和感官特性（图 1A）。因此，模型中有大量重要的化合物会对味道和口感产生影响，如在高度数酒中浓度较高的酯类，高级醇类，单萜类，降异戊二烯类，内酯类和酚类，与之相关的感官特性在高度数酒中也较突出，如苦味，涩味，粘度，辛辣度，粗糙和烧灼感。酒精度的重要性酒精浓度较低的葡萄酒（以较低的代码表示）位于图 1B 中的左侧，而酒精浓度较高的葡萄酒则位于图右侧。PC1 图中左侧为气味更偏重于果香和口感更甜的葡萄酒样品，相比之下，右侧则为酒味更浓，口感更苦涩的葡萄酒样品（图 1A）。低度葡萄酒 W1-7(12.4–13.8% v/v) 通常味道更甜，果香和奶香更浓，口感更丝滑。相反，图右侧的高度数葡萄酒 W8-24 (13.9–15.9% v/v)（图 2）通常更苦涩，木香味更重，整体气味更浓烈，酒精味重，并伴有辛辣，粗糙和烧灼感。位于图中右下象限的一组葡萄酒，包括W9、W12-13、W16-22 和 W24，密集成一簇，说明这些葡萄酒具有相似的化学和感官特性，尽管酒精浓度范围为 14.3–15.9% v/v。

其他感官特性还有一些感官特性不能很好地通过 PLSR 建模关联，可能是由于目前开发的气相色谱方法未能检测到相关的化合物，其中有一类含硫挥发性化合物就没有被检出。由于它们具有易挥发性，因此分析这些化合物往往需要特定的气相色谱柱和/或特定的检测器 [1]。有研究表明这些化合物影响着赤霞珠葡萄酒的品种特性。将来的工作包括扩大和调整 HS-SPME/GC/MS 方法的分析范围，将其他已知影响葡萄酒感官特性的重要挥发性化合物都包括在内。相反地，研究还发现，许多检出的化合物对葡萄酒没有任何感官的重要影响。这可能是因为其含量低于感官阈值，或者其在葡萄酒产生的感官特性无法被清晰准确地描述出来；也可能是混合作用的结果，挥发物之间的协同或者掩蔽作用使个体化合物的感官效应难以显现。

结论本研究开发了一种测定葡萄酒中大量挥发性化合物的靶向快速分析方法。此方法可以对一系列重要的感官描述语进行预测，无需繁琐的样品前处理或者使用更加昂贵的仪器（即，多维 GC或者 TOF MS）。该方法使用 HS-SPME/GC/MS 技术，采用SIM/SCAN 数据同步采集检测法，在优化灵敏度的同时有效提高了目标分析物的选择性。本研究通过此方法，发现美国市售的赤霞珠干红葡萄酒和混酿葡萄酒在化学性质和感官属性上存在差异，部分原因是由于酒精含量不同造成了直接和间接的影响。