三重四极杆液质联用系统对动物源性食品中硝基呋喃代谢 物兽药残留进行分析

摘要：本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用系统建立 了 4 种硝基呋喃代谢物（包括呋喃他酮 AMOZ、呋喃西林 SEM、呋喃妥因 AHD 和呋喃唑酮 AOZ）的分析方法。动物源性样品（肌肉、内脏、蜂产品、水产 品、乳制品等）经过盐酸水解衍生、乙酸乙酯提取后，采用薄壳型填料反相 C18 色谱柱 — Agilent Poroshell 120 EC-C18 分离，经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子 源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在正离子模式下监测。该方法在 0–5 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2 ≥ 0.995；在 0.5 µg/kg 添加浓度下，各 化合物峰面积 RSD 均小于 2%；各化合物定量下限均可达到 0.25 µg/kg。通过对 方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，得到所建立的方法能 在 12 min 内对 4 种硝基呋喃代谢物完成快速、高灵敏度的检测分析，同时采用 同位素内标法进行定量测定，*法规监测要求。

前言：硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真 菌和原虫等病原体均有杀灭作用。它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶 A， 干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮、 呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，曾广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由 大肠杆菌、埃希氏菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等动物消 化道疾病。研究发现呋喃西林、呋喃唑酮及其代谢物 3-氨基-2-恶唑酮 (3-amino-2- oxazolidinone, AOZ) 等具有致癌作用。欧盟已于 1995 年禁止在食用动物中使用硝基 呋喃类药物，我国也于 2002 年颁布了禁止使用该类兽药的禁令[1-3]。目前硝基呋喃类药物是国际动物源性食品贸易的必检项目，成为发达国 家限制第三国出口的技术贸易壁垒。硝基呋喃类药物对光敏 感，代谢快速，母体化合物在动物体及其产品中很快就降至 检测限以下，但其代谢物以蛋白结合物的形式在体内可残留 较长时间。显然检测硝基呋喃类药物母体化合物已不能反映 真实的用药情况。目前各国均将硝基呋喃代谢物作为指示硝 基呋喃类药物残留的标示物。

随着液质联用仪和技术近年来的快速普及以及对此类禁用 药物越来越苛刻的检测限要求，液质联用仪已成为动物 源性食品中硝基呋喃类药物残留量的主要检测确证技术手 段，被广泛应用于监督监管[4]。目前国内检测硝基呋喃类药 物的主要参照标准包括：《GB/T 21311-2007 动物源性食品中 硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联 质谱法》，《GB/T 21167-2007 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残 留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，《GB/T 20752-2006 猪 肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留 量的测定 液相色谱-串联质谱法》，《SN/T 1627-2005 进出口 动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量测定方法 高效液相 色谱串联质谱法》，《农业部 781 号公告-4-2006 动物源食品 中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱 法》和《农业部 783 号公告-1-2006 水产品中硝基呋喃类代 谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》等[5-10]。由于属于 禁用类药物，其检出为“零允许量”(Zero tolerance)，考虑 到 检测灵敏度能力，硝基呋喃代谢物检测限为 0.1 µg/kg。 针对此类禁用性药物的严格及苛刻的监测需求，本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用 系统 (1290/6495 LC/QQQ) 建立了快速检测 4 种硝基呋喃代 谢物的确证定量方法。该方法可以满足动物肌肉、内脏、 水产品、蜂产品、乳制品等动物源性食品中硝基呋喃残留 量的监测。

实验部分 试剂与化学品 所有试剂和溶剂均为色谱纯级或者分析纯级。甲醇、乙 腈和乙酸乙酯购自德国默克 (MERCK)。甲酸、乙酸铵、磷 酸钠、盐酸、氢氧化钠和邻硝基苯jia醛 (2-NBA) 购自美国 Sigma-Aldrich 公司。硝基呋喃代谢物的标准品（呋喃他酮 AMOZ、呋喃西林 SEM、呋喃妥因 AHD 和呋喃唑酮 AOZ）及 相应同位素内标（D5-AMOZ、13C3-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ） 购自德国奥格斯堡 (Dr. Ehrenstorfer)。 所有标准品用甲醇配制为 1 mg/mL 储备液，储存在 -20 °C 冰箱内（有效期 1 年左右）。用乙腈:水 (50:50) 配制混合工 作液 (10 µg/mL)，储存在 4 °C 下（有效期 1 个月左右）。其 中邻硝基苯jia醛用甲醇配制为 100 mmol/L。 仪器配置 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其由 下列部件组成： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 标准自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 自动进样器冷却器 (G1330B） • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统，在正离子模式下进行检测。 采用 Agilent MassHunter 工作站软件（B.07 或以上版本）进 行数据采集、确证和定量分析。

样品前处理 称取 2 g 均质后的样品（精确至 0.1 g）于 50 mL 聚四氟乙烯 离心管中，加入 5 mL 0.2 mol/L 盐酸、50 µL 100 mmol/L 邻 硝基苯jia醛溶液、100 µL 20 ng/mL 同位素内标溶液，涡动 1 min，反应混合物于恒温箱中 37 °C 放置过夜。 取出样品冷却至室温，加入 0.5 mL 0.3 mol/L 磷酸钠水溶 液，用 2 mol/L 氢氧化钠水溶液调节 pH 约 7.2。然后，分 别用 5 mL 乙酸乙酯提取两次，合并两次乙酸乙酯提取液， 40 °C 氮气吹干。残留物用 1 mL 起始流动相溶解，过滤膜 或高速离心后，待测。 液相色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 100 mm, 2.7 µm 柱温： 40 °C 进样量： 10 µL 自动进样器温度： 10 °C 流动相： A) 含 2.5 mmol/L 乙酸铵和 0.1% 甲酸的水溶液 B) 乙腈 流速： 0.4 mL/min

梯度程序： 时间 B% 0 10 5.0 30 7.0 98 9.0 98 停止时间： 10 min 后运行时间： 2 min 质谱条件 离子模式： 正离子 干燥气温度： 200 °C 干燥气流量： 15 L/min 鞘气温度： 370 °C 鞘气流量： 12 L/min 雾化器压力： 35 psi 毛细管电压： 4000 V 喷嘴电压： 0 V ∆ EMV 300 V MS1 和 MS2 分辨率 Unit MRM 参数 如表 1 所示

结果与讨论 6495 三重四极杆液质联用系统可充分满足对此类药物的 检测要求，在 MRM 方法列表中给出了 6495 的碎裂电压 (Fragmentor) 参考值。6495 具有新型的预四极杆离子传输聚 焦技术、弯曲锥形碰撞池及高能电子倍增管检测器设计， 可以大大提高离子的聚焦传输，产生更有效的离子碎片及 更多的离子/电子转化率，从而大大提高了灵敏度、稳定性 及抗污染能力。 本文采用含有薄壳型填料颗粒的 Poroshell 120 EC-C18 色 谱柱对硝基呋喃代谢物进行了有效的色谱分离，此填料 (2.7 µm) 和规格 (3.0 x 100 mm) 的色谱柱具有较高的分离柱 效和较高的柱载量，同时具有较低的色谱压力，非常适合 分析动物源性样品基质中药物残留。流动相中添加 0.1% 甲 酸和 2.5 mmol/L 乙酸铵可以促进正模式下的离子化效率。 所得结果如图 1 所示。

图 3. 蜂王浆基质中添加 0.5 µg/kg 硝基呋喃代谢物的加标样品的 MRM 谱图 由于考虑到色谱保留分离和灵敏度的需要，硝基呋喃代谢物 需要用邻硝基苯jia醛衍生后再分析测定，但需要注意代谢物 的衍生物稳定性较差，需要处理完后尽快上机测定。另外不 同基质样本需要注意衍生化效率，必要时需要采用 SPE 净 化后再衍生分析。所用处理试剂和对照品需要现用现配，避 免过期降解影响测定结果。本仪器方法适用于肌肉组织、内 脏、蜂产品、水产品、乳制品等样品中硝基呋喃代谢物的测 试分析。

结论 采用 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用系统成功实现了对动物源性食品中硝基呋喃禁用药物残留 量的高灵敏、快速确证定量分析。本方法以国内发布检测 标准为依据，方法学各项参数*或高于标准检测要求，并可应用于各类动物源性样品基质中硝基呋喃的快速 检测。