测定香料中的真菌毒素、 非法着色剂和农药

前言 ：香料自古以来就被用于食品的调味和着色。欧洲国家发生过很多香料安全性警 告事件，涉及不同种类的污染物。因此，通过一种多残留分析方法同时筛查和 定量农药、真菌毒素以及着色剂的需求越来越迫切。这类分析面临的主要挑战 包括复杂的基质、大量的分析物、化合物种类的多样性，以及分析方法必须覆 盖宽泛的浓度范围等。 本应用简报评估了在动态 MRM 和快速极性切换模式下运行的离子漏斗三重四极杆质谱仪对一系列痕量水平分析物进行准确定量分析的性能。此外，我们还评 估了旨在优化 MRM 间延迟时间的改良版软件和固件，其能够在低至 0.5 ms 的驻 留时间内获取高质量数据。 Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统具有优异的灵敏度，能够精准定量高度 稀释的样品中的农药、真菌毒素和着色剂，在降低基质效应的同时提高方法稳 定性。

实验部分 样品前处理 黑胡椒和辣椒粉购自当地杂货店，按 照 EN 15662 QuEChERS 前处理方法， 使用 Agilent BondElut QuEChERS 试剂 盒（部件号 5982-6650）进行提取。 使用 QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增强 型脂质去除净化基质试剂盒（部件 号 5982-1010）进一步纯化提取物， 然后进行 Polish 净化盐析萃取（部件 号 5982-0102）。最后，向提取物中加 入 2 ppb (10 µg/kg) 安捷伦综合农药混 标（部件号 5190-0551）、真菌毒素以 及着色剂标准品 (Sigma)，再用乙腈以 1:5、1:10、1:20、1:50 和 1:100 的比例 稀释加标后的提取物。 方法设计 使用 Agilent MassHunter 优化软件优化 五种真菌毒素和九种着色剂的 MRM 离子对，并使用安捷伦农药触发式多 反应监测 (tMRM) LC/MS 应用套装为 每种化合物确定至少两个 MRM 离子 对及其对应的 MS 条件。采用正离子 和负离子电喷雾电离，在动态 MRM (dMRM) 或 tMRM 模式下通过单次运 行执行分析。主要的 UHPLC 和 dMRM MS 参数如仪器条件表所示。

结果与讨论 评估经优化的 MRM 间延迟时间 我们开发了以 100 个 MRM 离子对（代 表 53 种农药）为分析目标的方法，用 于评估优化了 MRM 间延迟时间的改 良版软件和固件。图 1 显示了四个不 同的驻留时间内两种农药的叠加 MRM 色谱图，表明合适的 MRM 延迟时间 对于在短驻留时间内保持离子信号非 常重要。

方法开发及性能 我们首先采用针对目标真菌毒素和着 色剂化合物进行了优化的新离子对开 发了 MRM 方法。随后，使用新的化 合物离子对和观察到的保留时间数据 更新以 250 多种农药为目标的 dMRM 方法。 UHPLC 与经过优化的 6495B 三重四极杆质谱仪相结合，能够在大多数分析 物最大残留* (MRL) 10% 的定量下 限 (LLOQ) 水平对其进行定量分析。在 低至 2 ppt 的 LLOQ 到高至 100 ppb 的定 量上限 (ULOQ) 范围内，采用 13 个浓 度水平的标样评估方法的精度和准确 度，每个浓度执行五次重复进样。所 得结果表明，分析的精度（LLOQ 处的 RSD% < 20%，其余浓度水平 < 15%） 和平均准确度（LLOQ 处为 80%-125%， 其余浓度水平为 85%-115%）都很出色。 校准曲线的相关系数 (R2 ) 大于 0.99。

通过稀释提取物最大限度降低基 质效应 对复杂样品提取物进行稀释能够最大 限度降低基质效应，使得定量分析更 加准确，同时还能减少液质联用系统 所受的污染，从而提高分析稳定性。 表 1 显示了稀释操作对分析结果的改 善，其中黑胡椒样品中化合物的回收 率随着样品被进一步稀释而提高。 香料是一类非常具有挑战性的食品基 质，它们的性质很复杂，因而离子抑 制效应极为显著。由于观察到了着色 剂化合物损失，我们不能利用传统分 散式固相萃取净化来去除干扰性基质 化合物，这又导致基质效应进一步增 强。因此，稀释提取物对于降低离子 抑制效应而言十分关键，图 4 中的对 比结果表明，不同类型的香料适用的 稀释比例差别非常大。 我们所分析的样品中十分具有挑战性的 香料基质是黑胡椒。图 5 表明，要使 化合物回收率达到 > 90% 的可接受标 准，需要使用乙腈以 1:100 的比例稀释 提取物。6495B 液质联用系统固有的灵 敏度能够有效分析以适合比例 1:100 稀释的黑胡椒样品，同时仍能检出大 多数化合物，且峰面积 RSD < 20%。

使用触发式多反应监测 (tMRM) 进行确证分析 使用 dMRM 方法评估基质效应时， 我们发现辣椒粉的空白提取液（未加 标）中存在 20 多种农药和真菌毒素。 为了进一步确认此对照样品中的这些 化合物，我们使用 tMRM 方法，在一 个主要离子对的基础上采集了多达六个离子对，然后将完整的化合物谱图 与采用纯标准品创建的谱库进行比 对。定量分析也使用相同的数据。在 图 6 所示的例子中，以 1:20 比例稀释的 辣椒粉提取物中赭曲霉毒素 A 和黄曲 霉毒素 B1 的计算结果分别为 28 µg/kg 和 8.1 µg/kg。

结论 • 使用优化的 MRM 间延迟时间能 够将所用 MRM 驻留时间缩短至 0.5 ms，同时最大限度减小分析 物信号损失 • 真菌毒素和着色剂化合物被成 功纳入 UHPLC/MS/MS 农药方 法的目标分析物中，用于测定 260 余种化合物 • 使用 Agilent 6495B 液质联用系 统可提高分析灵敏度，精准定 量高度稀释的香料提取物中的 化合物，同时降低基质效应并 提高方法稳定性 • 本文还给出了香料中真菌毒素 化合物的确证分析所用的 tMRM 采集参数