液相色谱-串联四极杆质谱法测定海水和海底泥中的有机磷酸酯类阻燃剂

摘要： 本应用简报基于最近的论文[1]，介绍了基于液相色谱-串联四极杆质谱联用技术同时测定海水和海底泥中 22 种常见有机磷酸酯类 (OPEs) 阻燃剂的方法。海水中的 OPEs 经过极性修饰的 Agilent Bond Elut PPL 反相聚合物固相萃取柱富集和净化后，通过同位素稀释法进行定量。在 0.5–100 ng/L 的浓度范围内，大部分 OPEs 的线性响应良好，线性相关系数高于 0.99。海水中 OPEs 的方法检测限在 0.0003–0.79 ng/L 之间；低、中、高三个加标水平下的加标回收率和相对标准偏差分别在 51.8%–123.0% 和 0.7%–13.6% 之间；海底泥中 OPEs 的方法检测限在 0.0001–0.02 µg/kg 之间，加标回收率和相对标准偏差分别在52.1%–118.1% 和 1.5%–12.0% 之间。结果表明，该方法灵敏、准确、可靠，可以满足环境海水与海底泥样品中痕量 OPEs 检测的要求。

前言：有机磷酸酯 (Organophosphate esters, OPEs) 是由磷酸基团的氢被取代而形成的一类化合物，因其具有良好的阻燃性和延展性，常作为阻燃剂、增塑剂添加至塑料制品、纺织品、电子设备、建筑材料以及家具装饰材料等中。目前常用的 OPEs 类阻燃剂超过 20 种[2,3]。近年来，卤系阻燃剂由于对环境的严重危害而逐步受到限制，OPEs 类阻燃剂的用量逐年增加，其对生态环境和人类健康的影响日益受到人们的关注。有研究表明，OPEs 具有致癌性、神经毒性和生殖毒性[4,5]。OPEs 已经普遍存在于环境水体、底泥、土壤和生物体内中，但在海水和海底泥中的检测和对海洋环境和生态的影响所知不多，需要开展更广泛、更深入地研究。因此，亟需建立一种适用于检测海水和海底泥中 OPEs 的简单、全面、高效的方法，以评价 OPEs 对海洋环境的污染状况。OPEs 的检测方法主要包括气相色谱法 (GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法 (LC-MS) 等[3,6,7]。其中液相色谱-串联四极杆质谱法 (LC-MS/MS) 的优势在于灵敏度和选择性高，特别适用于分析复杂海水和底泥中分子量较大、不易挥发的 OPEs。本文将固相萃取技术与液相色谱-串联四极杆质谱相结合，建立了一种同时检测海水和海底泥中 22 种 OPEs 的分析方法。该方法简单、准确、基质干扰较少且回收率高，*满足海洋环境中OPEs 的分析要求。

实验部分： 试剂和样品实验用甲醇、甲酸、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯（美国 Fisher 公司）；实验用水为经 Milli-Q 系统净化的超纯水（电阻率 18.2 MΩ）。各种 OPEs 标准品及同位素标准品购自美国 AccuStandard 公司（100 µg/mL，以甲苯或异辛烷作为溶剂），配制工作液时，准确吸取一定量标准储备液，用氮气缓慢吹干，经甲醇重新定容后使用。实验用海水样品在取样后放入容器并冷藏于 4 °C 的冰箱中，底泥样品在烘干后经粉碎过筛放入容器中备用。仪器和设备采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱/Ultivo 三重四极杆液质联用(LC/MS/MS) 系统；Agilent Vac Elut 20 位固相萃取装置。其它设备：3K-15 离心机（美国 Sigma 公司）、氮吹仪（普立泰科公司）、涡旋混匀器（德国 IKA 公司）、Milli-Q 超纯水装置（美国Millipore 公司）。在样品前处理中采用 Agilent Bond Elut PPL 反相聚合物固相萃取柱 (200 mg, 3 mL)、Bond Elut Plexa (200 mg, 3 mL) 和 Bond ElutC18 (500 g, 6 mL)，Bond Elut 储液管 (60 mL)。色谱柱采用了 Agilent Zorbax Eclipse plus C18 (2.1 × 100 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell EC-C18 (2.1 × 150 mm, 2.7 μm) 和Agilent Zorbax SB-Aq (2.1 × 150 mm, 1.8 μm)。样品前处理准确量取 500 mL 海水样品，静置沉降后取上层清液，向其中加入 10 µL 1 µg/mL 混合内标液以及 50 mL 甲醇，混合均匀，待过柱。Bond Elut PPL（200 mg, 3 mL，部件号 12105005）柱在使用前用 3 mL 乙酸乙酯淋洗，开启固相萃取装置 3 min，将其抽干，然后用 3 mL 甲醇和 3 mL 水依次活化小柱，小柱上方用适配器连接 Bond Elut 60 mL 储液管（60 mL，部件号 131005）上海水样品，保持流速 5–8 mL/min；上样结束后用 10 mL 10% 甲醇水淋洗；开启固相萃取装置 3 min，将小柱抽干；然后用 6 mL乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液；氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，进 LC-MS/MS 进行检测。准确称取 5.0 (±0.05) g 海底泥样品，向其中加入 10 µL 1 µg/mL混合内标液，涡旋混合均匀；再加入 10 mL 乙腈并涡旋 1 min，超声提取 10 min；在 8000 r/min 下离心 5 min，取上清液加入50 mL 空离心管中；然后加入 10 mL 乙腈重复萃取一次，合并乙腈提取液，在 40 °C 下氮吹浓缩至 2 mL；加入 8 mL 水，涡旋混合均匀；过 Bond Elut PPL 柱，控制流速为 1–2 mL/min。其它操作与海水样品前处理操作相同。

液质分析条件色谱柱： Agilent ZORBAX SB-Aq, 2.1 × 150 mm, 1.8 µm，部件号 859700-914柱温： 40 °C进样量： 2 µL流动相： A) 0.1% 甲酸水溶液 B) 甲醇流速： 0.3 mL/min梯度程序： 时间 (min) B (%)0 5010 6212 7022 7527 10032 100后运行时间： 5 min质谱分析条件离子模式： ESI，正离子模式干燥气温度： 250 °C干燥气流速： 6 L/min鞘气温度： 350 °C鞘气流速： 11 L/min雾化器压力： 30 psi毛细管电压： 3000 V喷嘴电压： 0 V多反应监测 (MRM) 采集参数：见表 1

结果与讨论：质谱与色谱条件的优化首先在正离子模式下进行质谱扫描以得到目标化合物的 [M+H]+ 母离子，然后分别优化毛细管碎裂电压和碰撞电压，使碎片离子强度尽可能高。最终选择离子强度最高和次高的碎片离子，分别用于化合物的定量和定性确认。优化后的各参数见表 1。确定质谱参数条件后，由于存在 TPrP/TiPP、TnBP/TiBP 和o-TCP/m-TCP/p-TCP 三对同分异构体，因此选取 Agilent ZorbaxEclipse plus C18、Poroshell EC-C18、Zorbax SB-Aq 三种色谱柱以及水/甲醇、水/乙腈两种流动相体系，考察不同分离体系的分离效率。选择 Zorbax SB-Aq 色谱柱和 0.1% 甲酸水溶液/甲醇体系进行分离，经梯度优化后，所得典型色谱图如图 1 所示，各组同分异构体基本实现了基线分离。对于海水和生物样品等复杂基质，当目标化合物流出色谱柱后，采用纯甲醇继续冲洗5 min，使残留基质尽可能流出色谱柱。

海水样品萃取净化条件的优化本方法中涉及的各种 OPEs 化合物包括从强极性小分子 TMP 到非极性较强的化合物 TFHP，理化特性差异较大。考虑到海水中的基质干扰物质主要为盐类，并且海水中的痕量目标化合物的检测限要求苛刻，因此需要对 OPEs 进行富集。传统的液液萃取方法主要依靠手动操作，耗时较长，因此本研究考虑使用反相固相萃取柱进行萃取和富集，且评估了不同聚合物反相固相萃取柱 Bond Elut PPL 和 Plexa (200 mg, 3 mL) 以及硅胶基体反相柱 Bond Elut C18 (500 mg, 6 mL) 的性能。将 10 mL 水加入一定量的代表性 OPEs 标准品中，参考安捷伦应用文献[8] 采用甲醇:乙腈 (50:50, V/V) 进行洗脱，然后根据 OPEs 的回收率来选择合适的固相萃取小柱。从图 2 中可以看出，采用 Bond ElutPPL 使大多数化合物均获得了良好的回收率，但是仍然需要优化洗脱条件以改善几种 OPEs 的回收率。

考虑到回收率较低的化合物具有强的非极性，参考安捷伦应用文献[8] 尝试不同的上样溶剂和洗脱溶剂来优化 Bond Elut PPL 对OPEs 的保留和洗脱。首先采用洗脱体积 5 mL，从丙酮-乙酸乙酯(1:1)、正己烷-二氯甲烷 (1:1)、乙腈-甲醇 (1:1)、乙腈、5% 氨化乙腈和乙酸乙酯中筛选出合适的洗脱溶剂，然后进一步优化洗脱体积。最终确定采用 6 mL 乙酸乙酯，能够使大多数 OPEs 化合物获得可接受的回收率结果，结果如图 3 所示。采用超纯水作为上样溶剂评价基质。分别在 500 mL 水样中分别加入 25、50、75、100 mL 甲醇过 PPL 柱时，发现加入 50 mL甲醇时使部分非极性 OPEs 的绝对回收率得到较大程度的改善。当甲醇含量过高时，多种化合物在 500 mL 的上样体积下会发生不同程度的穿漏，部分极性较强的 OPEs 的回收率极低，结果如图 4 所示。最终选择在 500 mL 水中加入 50 mL 甲醇混合后上样（甲醇含量约 10%）。

结论本文采用液相色谱-串联四极杆质谱法结合同位素稀释法同时测定海水与海底泥中 22 种常见有机磷酸酯类阻燃剂。该方法可有效富集并去除基质干扰，灵敏度高，线性范围宽。针对海水样品，各种 OPEs 化合物的回收率结果均在 52.1%–118.1% 之间，相对标准偏差均小于 12.0%；在底泥中各种 OPEs 化合物的回收率结果均在 52.1%–118.1% 之间，相对标准偏差均小于 12.0%，方法整体回收率和精密度均满足准确定量要求，适用于分析海水和海底泥中的痕量 OPEs。