采用安捷伦三重四极杆液质联用快速测定谷物中16种真菌毒素

摘要：本文采用安捷伦三重四极杆液质联用系统，建立了同时检测主要谷物中 16 种 真菌毒素的分析方法。小麦、玉米、稻谷等样品经粉碎后采用乙腈-水-乙酸 溶液（70:29:1，v/v/v）提取，样品溶液经 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) 分离，使用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统进行监测，同时采用 14 种 13C 标记的真菌毒素作为稳定同 位素内标来提高方法的准确度。本方法前处理操作简单，线性相关性 良好，相关系数 R2 > 0.996；在小麦、玉米基质中 16 种真菌毒素 3 个水平的加标 回收率基本都在 85%-120% 之间，平行样品测定的 RSD 在 0.7%-8.2% 之间。采用 本方法对 FAPAS 阳性样品进行测定，测定值符合 FAPAS 的规定值，验证了方法 的准确性。在此基础上建立了同时测定 16 种真菌毒素的 UHPLC-MS/MS 电子方 法 (e-Method)，使方法建立与优化大大简化。通过在国内外多个实验室不同型号 的安捷伦液质联用系统上采用 e-Method 进行实验室间验证，证实了检测方法的 准确性和 e-Method 的可行性。

 前言：真菌毒素是真菌生长过程中产生的一系列有毒有害物质， 目前在自然界中已发现的真菌毒素大约有 400 多种[1,2]，对 人类和动物具有致癌、致畸和致突变等毒性[3,4]。粮食中 的真菌毒素种类很多，常见的有黄qu霉毒素 (AFT)、赭曲 霉毒素 (OTA)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、伏马毒素 (FB) 和 T-2 毒素 (T-2) 等。对粮食中真菌 毒素污染及时、快速的监测、检测和控制，为人类提供安 全的口粮、为动物提供安全的饲料，成为摆在各国面前的 一个重要课题。目前，真菌毒素的检测方法主要有薄层色 谱法、荧光光度法、酶联免疫法、液相色谱法和液相色谱质谱联用法等。对于多残留分析和污染物分析，液相色谱串联质谱已被证明是一个强大的工具，可实现不同谷物中 多种真菌菌素的同时测定[5]，具有高灵敏度和高选择性。 本文采用安捷伦三重四极杆液质联用系统，建立了同时快 速检测主要谷物中常见的 16 种真菌毒素的可靠定量方法。 该方法可以满足对谷物中常见多种真菌毒素的高通量快速 监测。

实验部分： 试剂和样品 所有试剂和溶剂均为色谱纯级或者分析纯级。甲醇、乙 腈购自德国默克 (MERCK)。甲酸、乙酸、乙酸铵购自美 国 Sigma-Aldrich 公司。16 种真菌毒素包括雪腐镰刀菌烯 醇 (NIV)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、脱氧雪腐镰刀菌 烯醇-3-葡萄糖苷 (DON-3G)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-AcDON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15-AcDON)、 黄qu霉毒素 B1 (AFB1)、黄qu霉毒素 B2 (AFB2)、黄qu霉毒素 G1 (AFG1)、黄qu霉毒素 G2 (AFG2)、赭曲霉毒素 A (OTA)、T-2 毒素 (T-2)、HT-2 毒素 (HT-2)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、伏马毒素 B1 (FB1)、伏马毒素 B2 (FB2)、杂色曲霉毒素 (ST)，14 种 同位素内标包括 [13C15]-NIV、[ 13C15]-DON、[ 13C17]-3-AcDON、 [ 13C17]-AFB1、[ 13C17]-AFB2、[ 13C17]-AFG1、[ 13C17]-AFG2、[ 13C20]- OTA、[ 13C24]-T-2、[ 13C22]-HT-2、[ 13C18]-ZEN、[ 13C34]-FB1、[ 13C34]- FB2、[ 13C18]-ST 购自 Romer 实验室（奥地利）。

仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其配备安 捷伦组件有以下两种方案： • G4220A 型二元泵、G4226A 型自动进样器、G1316C 型柱 温箱 • G7120A 型高速泵、G7167B 型高通量进样器、G7116B 型 多柱柱温箱 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 6460/6470/6490/6495 三重四极杆液质联用系统进行检测。 采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行数据采集、确证和 定量分析。 标准品制备 分别配制 16 种真菌毒素的单标储备液，其中 AFB1、AFB2、 AFG1 和 AFG2 采用甲醇做溶剂，FB1、FB2 采用乙腈:水（50:50， v/v）做溶剂，其余化合物采用乙腈做溶剂，于 -20 °C 保 存。分别移取一定体积的 16 种真菌毒素单标储备液于 10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，配制真菌毒素混合标准工作 液，于 -20 °C 保存，浓度详见表 1。分别移取一定体积的 14 种真菌毒素稳定同位素单标溶液于 10 mL 容量瓶中，用 水定容至刻度，配制稳定同位素内标混合标准工作液，于 -20 °C 避光保存，浓度详见表 2。

样品前处理 小麦、玉米、稻谷等样品经粉碎机粉碎，过 1 mm 孔径试验 筛，混匀。准确称取 5 g 制备好的样品于 50 mL 离心管中， 加入 20 mL 提取液乙腈-水-乙酸混合液（70:29:1，v/v/v）， 并用涡旋混合器混匀 1 min，置于旋转摇床上振荡提取 30 min，然后以 6000 r/min 离心 10 min，吸取 0.5 mL 上清液 于 1.5 mL 离心管中，加入 0.5 mL 水并涡旋混匀，在 4 °C 下 以 12000 r/min 离心 10 min，上清液过 0.2 μm 的聚四氟乙烯 滤膜。吸取 180 µL 样品滤液于 400 µL 内插管中，加入 20 µL 稳定同位素内标混合标准工作溶液，涡旋混匀待测。

液相色谱条件 色谱柱： Agilent Eclipse Plus C18，2.1 × 100 mm， 1.8 μm，部件号 959764-902 流速： 0.3 mL/min 柱温： 35 °C 进样体积： 2 μL 流动相： A）含 1% 乙酸和 5 mmol/L 乙酸铵的水溶液 B）甲醇 梯度程序： 时间 (min) B% 0.0 10.0 2.0 10.0 3.0 20.0 7.0 24.0 10.5 30.0 13.5 60.0 15.0 70.0 18.0 75.0 18.1 95.0 21.9 95.0 22.0 10.0

质谱条件：本文所用安捷伦三重四极杆液质联用系统均配备 安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源，具体离子源的 参数见表 3。对于采用 iFunnel 离子传输聚焦技术 的 Agilent 6490/6495 三重四极杆液质联用系统， 高压离子漏斗 RF 150(+)/90(-)，低压离子漏斗 RF 60(+)/60(-)。 质谱根据化合物的保留时间，设置时间段分别进行 采集，时间段的设置详见表 4。Delta EMV 根据所用 仪器型号分别设置，以满足灵敏度的需求。为了尽 量减少样品基质对测定的影响，HPLC 流路在分析 的前 1.8 min 和 18 min 后切换至废液瓶。 16 种真菌毒素和 14 种同位素内标的 MRM 参数详见 表 5。

结果与讨论： UHPLC-MS/MS 条件优化 根据每种化合物灵敏度的不同，选择浓度为 0.5-2.0 μg/mL 的单标溶液分别优化质谱参数。真菌毒素类化合物可能 形成 [M+H]+ 、[M+NH4] + 、[M+Na]+ 、[M-H]– 、[M+HCOO]– 和 [M+CH3COO]– 等不同形式的加合离子，各种加合离子的响 应强弱与化合物本身的性质和流动相体系的组成有关。NIV 的 [M+H]+ 和 [M-H]– 的响应均较弱，在含有乙酸的流动相体 系中 [M+CH3COO]– 的响应有非常显著的提高；DON-3G 有同 样的趋势，最终我们选择 NIV、DON、DON-3G 采用负模式 检测，均采用 [M+CH3COO]– 为母离子。同样在负模式下检 测的还有 ZEN，选择 [M-H]– 为母离子。采用正模式检测的 真菌毒素中，15-AcDON、T-2、HT-2 选择 [M+NH4] + 作为母 离子，其余真菌毒素选择 [M+H]+ 为母离子。对于绝大多数 化合物来说，正模式下喷嘴电压设置为 0 V 时，灵敏度最 高，但对于 FB1、FB2，设置适当的喷嘴电压反而会使响应 提高。在本方法中 FB1、FB2 出峰的时间段，设置喷嘴电压 为 500 V，虽然同一采集时间段的其他化合物会损失一定 的灵敏度，但响应较低的 FB1、FB2 的响应均可提高 50% 以 上，提高了本方法的整体检测能力。