毛细管 HPLC-ICP-MS 分析微升体积的植物汁液中锌的形态

前言 许多金属元素对于正常的植物生长和发育非常重要。其中一种金属元 素就是锌，它通常是生物体中第二丰富：的过渡金属，并且作为重要的 微量营养元素在植物生理学中发挥着不同的作用。锌是 300 多种酶的 主要成分。它负责基因调控和蛋白质结构的稳定，包括锌指、锌簇和 RING 指结构域。锌还参与光合作用和 CO2 固定等基本过程。植物中 的锌过量或缺乏将导致植物死亡率高、生长迟缓和萎缩、萎黄病、坏 死、小叶病和开花延迟。所有这些症状都可能对食品安全产生严重影 响，因为与锌可利用性相关的作物产量将显著降低 [1-3]。

通过鉴定植物汁液中存在的低分子量含金属化合 物，有助于更深入地了解植物生理学，并且确定其 准确的功能，这将进一步促进营养、农业和环境研 究。然而，复杂生物基质如植物样品的研究可能在 样品前处理或色谱分离过程中存在若干问题。主要 的挑战与金属配合物的低浓度及其多样性有关。此 外，金属配合物通常不稳定，能够在萃取、离线预 浓缩步骤、甚至色谱分离中发生降解。在迄今为止 所研究的色谱技术中，体积排阻色谱 (SEC)、亲水 相互作用色谱 (HILIC) 和反相 (RP) 色谱已被证明是 适合避免金属配合物在分析过程中发生降解的技 术 [4]。由预浓缩柱和 HILIC 或 RP 分离柱组成的色 谱系统似乎是此类应用的理想选择。 本研究提出一种 ICP-MS 辅助的金属组学方法用于 分离豌豆后韧皮部中存在的锌形态分析。通过具有 在线预浓缩功能的毛细管 HPLC-ICP-MS 对胚囊液体 进行分析。由于植物汁液量非常少，所以需要使用 毛细管色谱

实验部分：样品 本文对来自发育中的豌豆豆荚（嫩豌豆）的胚囊液 体（后韧皮部）进行了研究。 样品前处理 用玻璃毛细管在豆荚中穿孔，使用蠕动泵提取液体 胚乳，将其放入保存在冰上的 Eppendorf 管中。收 集完成后，立即将样品置于液氮中冷冻，并在进 一步分析之前将其置于 -20 °C 的温度下储存。在分 析之前，将样品解冻，并用乙腈按 1:2 的比例（样 品：乙腈）进行稀释，然后在 10000 rpm 的转速下 离心 2 分钟。收集上清液并立即进行分析。

HPLC-ICP-MS等离子体质谱系统 使用配备毛细管泵和手动进样阀（定量环尺寸： 100 µL）的 Agilent 1100 液相色谱仪。将 30 µL 上清 液进样至 SeQuant 两性离子型 (ZIC-) HILIC 保护柱 （Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 5 mm × 1 mm（内 径），5 µm）中，使用 90% 乙腈和 10 mM 甲酸铵缓 冲液 (pH 5.5) 进行等度洗脱 (20 µL/min)。用流动相 将样品清洗 4 min，然后反冲至用于化合物分离的 SeQuant ZIC-HILIC 毛细管柱（Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 150 mm × 0.3 mm（内径），3.5 µm）。使用 洗脱液 A（10 mM 甲酸铵缓冲液 (pH 5.5)）和洗脱液 B（乙腈），进行流速为 4 μL/min 的梯度洗脱。

使用含有 20 ppb Y、Li、Tl、Ce 溶于 2% 硝酸中的 调谐溶液，在每天开始时自动对 ICP-MS条件进行 优化。7700x 的 ORS3 碰撞/反应池在高能量氦模式 下操作，以排除可能出现于 Zn 同位素中的多原子 干扰。使用 60 ms 的驻留时间采集 64Zn 和 66Zn 的信 号。ICP-MS 操作条件见表 2。

结果与讨论 获得的嫩豌豆后韧皮部的 64Zn 的色谱图如图 2 所 示。使用具有在线预浓缩功能的毛细管 ZIC-HILIC ICP-MS 使我们能够获得尖锐的高强度色谱峰，并对 两种锌形态进行分离和检测（图 2a 和 2b）。使用 ESI Orbitrap MS/MS 鉴定两种金属配合物。ICP-MS 检测对于测定不同锌形态的保留时间和估计质量平 衡至关重要。这简化了在 ESI-MS 质谱图中搜索锌 配合物的步骤。质谱图的放大部分（图 2d 和 2e） 清晰地显示了两种包含锌的同位素模式的离子。这 些提取离子色谱图 (EIC) 的保留时间与通过毛细管ZIC-HILIC ICP-MS 观察到的两个锌的峰（图 2c）具有 良好的一致性。获得的数据使我们能够鉴定两种锌 配合物：锌-烟草胺 (NA) 和锌-(组氨酸)2（表 3）。

由毛细管 HPLC 和 ICP-MS 组成的色谱系统使我们获 得的 64Zn（约 6 fmol 的 Zn-NA 配合物）的检测限为 75 ng/L，该检测限是由基线上 20 个点的标准偏差的 3 倍计算得到。将该数值与 Zn-NA 配合物的信号进 行比较，所获得的 64Zn 的色谱柱回收率为 70-80%。

结论 ：本研究展示了一种有效的 ICP-MS 辅助的金属组学 方法，用于分离和鉴定存在于豌豆后韧皮部中的 锌配合物。使用 ZIC-HILIC 预柱对锌形态进行预浓 缩，然后通过 ZIC-HILIC 毛细管柱进行分离。通过 毛细管 HPLC 与 ICP-MS 和 ESI MS/MS 仪器联用获 得的数据组合可用于鉴定不同的锌配合物。由于植 物汁液量非常少，所以需要使用毛细管色谱。另 外，具有在线预浓缩功能的色谱系统非常适用于分 析包含低浓度金属形态（其有时也不稳定）的生物 样品。本方法已成功用于鉴定两种锌形态：锌-烟 草胺 (NA) 和锌-(组氨酸)2 配合物，证明 NA 和组氨 酸是嫩豌豆后韧皮部中的两种与锌形成配合物的主 要配体。