检测通过亲水相互作用色谱对植物基质中的未衍生化氨基酸进行定量分析

摘要：本应用简报介绍了一种使用三重四极杆液质联用系统定量分析多种未衍生化氨基酸的方法。结果显示，即使在存在大量植物基质（黄瓜茎叶组织萃取物）的情况下，灵敏度、线性与回收率均十分出色。使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 可分离强极性氨基酸。在 LC/MS 兼容条件下，充分利用新一代 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 固定相优异的分离度和峰形。

前言：多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中。之前的研究中发现1 ，使用配备低 pH 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸，能够获得出色的分离度与灵敏度。本应用简报对这些条件进一步优化，以对植物中的氨基酸进行定量分析。试剂与化学品所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。超 LC/MS 级乙腈购自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的净化处理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 完成。试剂级甲酸（FA，部件号 G2453-85060）来自安捷伦科技公司。甲酸铵和氨基酸标样购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下储存。 • Agilent InfinityLab 接头 • 色谱柱前端：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头（部件号 5067-5965） • 色谱柱末端：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色谱接头（部件号 5067-5966） • 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，经认证，2 mL （部件号 5182-0716） • 安捷伦固定螺口盖，带 PTFE/红色硅胶隔垫（部件号 5190-7024） • Eppendorf 移液器和连续分液器 • 涡旋器和多管涡旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • Agilent InfinityLab 溶剂瓶，棕色，1000 mL（部件号 9301-6526） • Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶安全盖，GL45，3 个插口，1 个放空阀（部件号 5043-1219） • 离心机 (VWR, Radnor, PA, USA) • 超声仪 (VWR, Radnor, PA, USA)

仪器 • Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B) • Agilent 1260 Infinity 自动进样器 (G7129A) • Agilent 1260 Infinity 柱温箱 (G1316A) • Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超低扩散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站软件 • Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统 • 安捷伦喷射流电喷雾离子源

样品前处理：将氨基酸标准品与水混合至规定浓度，无需进一步样品前处理即可直接分析。接下来，将 15N 富集的氘代内标 (ISTD) 加入到下列每个样品中，至终浓度为 1500 ng/mL：异亮氨酸15N1、甲硫氨酸-d8、丙氨酸-d3、甘氨酸-d2、谷氨酸15N1、天冬氨酸-d3 和赖氨酸-d8。新鲜采集黄瓜叶片并立即置于液氮中快速冷冻，制备得到黄瓜茎叶组织萃取物。使用研钵和研杵将冷冻的黄瓜茎叶组织在液氮中均质研磨成细粉，然后储存于 –85 °C 的冰箱中。

称取 100 mg 冷冻的黄瓜叶片粉末到 2 mL Eppendorf 微量离心管中，加入 1 mL 0.5 M 盐酸水溶液进行萃取。将离心管以 8000 rpm 的转速涡旋混合 20 分钟，在 25 °C 水浴中超声 20 分钟，然后在 20000 g 下离心 20 分钟。后，将 250 µL 萃取上清液转移到已加入 ISTD 的液相色谱样品瓶中，然后用 80% 乙腈水溶液稀释至 1 mL。

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结论：将 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的出色分离度和峰形性能与强大的 结论将 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的出色分离度和峰形性能与强大的 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统结合，实现植物组织中未衍生化氨基酸的痕量分析。结果表明，该方法即使在基质中也具备可定量、可重现且稳定的优势。系统结合，实现植物组织中未衍生化氨基酸的痕量分析。结果表明，该方法即使在基质中也具备可定量、可重现且稳定的优势。