分析不同蜂蜜的植物来源-固相微萃取和气质联用系统

摘要 ：本文基于固相微萃取和气相色谱质谱 (SPME-GC/MS) 非靶向测定蜂蜜中挥发性组分， 结合化学计量学方法建立了不同植物来源蜂蜜判别和预测的方法。利用 SPME-GC/MS 对来自四种植物来源（包括洋槐蜜、椴树蜜、荆条蜜和油菜蜜）的 87 个真实蜂蜜样 品中的全谱挥发性化合物进行非靶向分析。通过主成分分析 (PCA) 对样品进行质量控 制。然后，建立基于偏小二乘判别分析 (PLS-DA)、朴素贝叶斯 (NB) 和误差反向传 播人工神经网络 (BP-ANN) 的样品分类预测模型。模型的准确率为 100%，这表明不 同植物来源蜂蜜可以准确分类。此外，还通过另外一组独立的 20 个真实蜂蜜样品， 对模型的可靠性和实用性进行了验证。所有 20 个样品均得到准确分类。后，对椴 树蜜的特征挥发性化合物进行初步鉴定。这表明，本研究建立的不同植物来源蜂蜜 判别方法是准确、可靠的，同时有助于寻找蜂蜜中的特征化合物。

前言： 蜂蜜以其营养和药用特性成为了世界上受欢迎的天然产物之一。蜂蜜的植物来源 和产地受到消费者的日益关注。蜂蜜的价 格通常与其植物来源/产地有关。因此， 很有必要开发一种快速强大的方法来鉴定 不同来源的蜂蜜。GC/MS 在识别和定量 分析复杂样品中的有机化合物方面具有优 势，与固相微萃取 (SPME) 的组合可用于 分析蜂蜜中的挥发性化合物[1]。 本应用简报介绍了近发表的一项关于非 靶向挥发性化合物图谱的研究[2]，该研究 结合使用 SPME 和 GC/MS 与化学计量学 方法，对中国蜂蜜的植物来源进行分类。 该研究开发出一种基于非特异性挥发性化 合物指纹图谱和多变量分析分类并预测蜂 蜜植物来源的方法。应用 SPME-GC/MS 在全扫描模式下非靶向采集蜂蜜的全谱挥 发性化合物数据。使用各种过滤参数进行 多变量优化。然后，建立基于偏小二乘 判别分析 (PLS-DA)、朴素贝叶斯 (NB) 和 误差反向传播人工神经网络 (BP-ANN) 的 预测模型。对于具有显著性差异的 化合物进行了初步确认

材料与方法 ：蜂蜜样品 87 个真实蜂蜜样品，包括 19 个洋槐 (Robiniapseudoacacia L.) 蜜样品、22 个 椴树 (Tilia amurensis Rupr.) 蜜样品、 22 个荆条 (Vitexnegundo var. heterophyllaRehd.) 蜜样品和 24 个油菜 (Brassica campestris L.) 蜜样品，分别采 集自中国北京、吉林、河北和陕西。从养 蜂人处直接采集 500 g 以上的各种蜂蜜样 品，并保存在 4 °C 的冰箱中待分析。 固相微萃取 使用 CTC 自动进样系统和 2 cm 涂有 50/30 µm 二乙烯苯/Carboxen/聚二甲 基硅氧烷 (DVB/CAR/PDMS) 的纤维头 （部件号 SU57348U）运行 SPME 程序。 分析前，将纤维置于气相色谱进样口中， 在 270 °C 下老化 1 小时。SPME 条件如 下：将 3 g 蜂蜜放入包含 1.5 mL 去离子 水和 0.5 g 氯化钠的 20 mL 顶空螺纹口样 品瓶（部件号 5183-4474）中，并用聚四 氟乙烯 (PTFE)/硅橡胶隔垫（部件号 5183- 4477）将样品瓶密封。然后在 80 °C 下， 将涂有 DVB/CAR/PDMS 的纤维头置于样 品溶液的顶部空气中暴露 30 分钟。完成 萃取步骤后，将纤维头从样品瓶中取出并 插入气相色谱进样口中，在 250 °C 下进 行 2 分钟热脱附。 数据处理和统计分析 利用 Agilent MassHunter GC/MS 转换软 件 B.07.00 版将 Agilent ChemStation 数 据转换为 MassHunter 数据。将转换后的 GC/MS 数据导入 MassHunter 未知物分析 软件（B.07.01 版）中，并根据未知物分 析的优化参数进行解卷积和鉴定。将处理 后的蜂蜜样品轮廓图导出为 cef 文件，然 后导入 Agilent Mass Profiler Professional （13.0 版）中。 采用化学计量学方法，例如主成分分析 (PCA)、单因素方差分析 (ANOVA) 和预测 模型（包括 PLS-DA、NB 和 BP-ANN）。 图 1. 本研究所用的部分蜂蜜样品 化学品 己烷（MS 级）购自 Fisher Scientific（中 国上海）。正己烷购自 Sigma-Aldrich，并 采用一系列烷烃 (C8H18–C25H52) 计算保留 指数。利用癸酸甲酯 (Sigma-Aldrich) 作 为内标。实验用水产自 Milli-Q 水纯化系 统 (Millipore, Bedford, MA, US


结果与讨论： 数据挖掘 使用 Agilent MPP 软件进行数据过滤和化 学计量学分析。对所有 cef 文件进行数据 过滤。对于四组样品，通过数据匹配总共 获得了 2734 个化合物。根据 MPP 工作 流程，第yi个过滤器是按标记进行过滤， 该步骤用于消除不可靠的化合物。根据 各个样品是否高于阈值或达到饱和设置 “存在”和“临界”标志，以从整个数据 集中过滤化合物。保留了 87 个样品中至 少 2 个样品中可接受的化合物。第二个 过滤器是按频率过滤，根据化合物在样 品中的出现频率对其进行过滤。在该步 骤中，必须是存在的化合物才可进行该 步过滤。这些过滤条件保留了每个样品 中在至少一种条件中出现的化合物。第 三个过滤器是显著性分析，根据单因素 方差分析计算出的 p 值。为确保仅保留 存在显著差异的化合物，在大多数情况 下，选择的 p 值截止值为 0.05。经过三 个过滤步骤，将化合物数量从 2734 减少 至 114。为鉴定处理样品和对照样品之间 的丰度比或差异超出给定倍数变化截止值 或阈值的化合物，采用倍数变化分析作 为终过滤步骤。当倍数变化截止值为 2 时，保留了 110 个化合物，表明一系列 过滤步骤显著减少了变量数量和数据集的 维数。


主成分分析 PCA 是常用的无监督的统计方法，可 以对数据进行降维处理，消除众多复杂 信息中重叠的部分，尽可能地用少数变 量来解释数据中的大部分信息。根据先 前的过滤结果，将 PCA 应用于四个植物 来源的 87 个蜂蜜样品，以分析其自然分 组。一般而言，如果前四个 PC 能够解释总变量的 75%，则认为模型是准确可靠 的。[3] 有必要进一步选择并减少前文提及 的变量，从而提高模型的可靠性。倍数 变化截止值可根据上述过滤步骤进行优 化。将 PC1-PC4 解释的总变化视为评估 标准，选择的倍数变化截止值为 200。图 2 显示了倍数变化截止值为 200 的蜂蜜样 品的得分图。椴树蜜样品位于第yi主成分 (PC1) 的右侧，而其他三种类型的蜂蜜位于 PC1 的左侧。因此，PC1 将蜂蜜样品 清楚地分为椴树蜜和非椴树蜜。椴树蜜和 油菜蜜样品均具有正 PC2，而荆条蜜和 洋槐蜜样品均具有负 PC2。PC1 和 PC2 分别占方差的 35.35% 和 25.38%，且前 四个 PC 占总变量的 79.12%。因此，选 择 200 作为倍数变化截至值，同时将这 70 个保留下来的化合物作为变量用于模 型建立。

模型建立与预测 PCA 结果表明，过滤后的数据可用于区分 蜂蜜样品的植物来源。以上述 70 个化合物 为变量，应用化学计量学方法建立溯源模 型，用于对各种来源的蜂蜜进行分类和预 测。本研究基于 87 个真实蜂蜜样品（包括 19 个洋槐蜜样品、22 个椴树蜜样品、 24 个油菜蜜样品和 22 个荆条蜜样品）建 立了三种分类模型，即 PLS-DA、NB 和 BP-ANN。模型训练和验证过程中正确分 类蜂蜜样品的百分比证明了这些模型的识 别和预测能力。表 2 列出了这三种模型的 准确度，100% 的蜂蜜样品得到准确分类。 尽管模型训练中的识别能力和模型交叉 验证中的预测能力为 100%，但采用原始 87 个真实蜂蜜样品中不包括的样品对建立 的模型进行验证仍然*。因此，将 另外 20 个未包括在统计模型开发过程中的 真实蜂蜜样品（包括每种植物来源各 5 个 蜂蜜样品）作为测试集进行分析。表 3 列 出了预测结果和置信度。所有 20 个真实 蜂蜜样品均得到正确预测。尽管预测组 与实际组一致，但对于 PLS-DA、NB 和 BP-ANN 模型，置信度的值有所不同。

挥发性化合物标记物的鉴定 利用维恩图对不同植物来源蜂蜜在预测模 型中的化合物列表进行确认。图 3 显示了 各种植物来源的化合物列表和交叉情况。 洋槐蜜、荆条蜜、椴树蜜和油菜蜜的化合 物列表分别包含 50、43、52 和 47 个化 合物。由于椴树蜜在质量和价格上均优于 其他蜂蜜，因此标记物鉴定的重点放在 在椴树蜜样品中发现的挥发性化合物。 图 3 显示了初步选择的仅出现在椴树蜜 中的八种挥发性化合物。通过 NIST 对它 们进行初步鉴定。表 4 列出了它们的保 留时间、保留指数、离子和参考文献。 除戊酸、2-甲酸酐外，椴树蜜中的所有 其他化合物均在参考文献中有报道[5-8]。 其中，Blank 等人提出将顺式玫瑰醚作为 椴树蜜的指示剂[6]。Blank 还从椴树 (Tilia cordata) 花中发现了这种化合物，但在其 他类型的蜂蜜中并未发现[6]。尽管缺少有 关椴树花中挥发性化合物的文献报道，但 表 4 列出的化合物也被初步视为椴树蜜 的标记化合物。这些化合物在区分椴树蜜 与其他蜂蜜方面有重要意义。

结论 本研究成功应用了基于 SPME 和非靶 向 GC/MS 分析与化学计量学方法结合的 分类方法来区分各种植物来源的蜂蜜样 品。基于 87 个真实蜂蜜样品建立了三种 分类模型，即 PLS-DA、NB 和 BP-ANN， 模型准确度为 100%。另外 20 个真实蜂 蜜样品的预测结果表明，所开发的模型实 用而可靠。因此，SPME-GC/MS 测定非 特异性轮廓结合化学计量学方法在不同植 物来源分类和判别方面具有广阔的应用 前景。