使用Agilent 96孔板进行生物体液样品的蛋白质沉淀

摘要:蛋白质沉淀技术 (PPT) 是适于 LC/MS/MS 分析的生物体液样品前处理的常用技术之一。将蛋白质沉淀应用于生物体液样品，可以从基质中有效去除蛋白质。本应用简报讨论了生物体液样品 PPT 的重要步骤、考虑因素和注意事项。本文重点介绍使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板的孔内 PPT，包括合适的沉淀溶剂、比例、添加剂、生物体液基质、生物体液样品等分和沉淀溶剂的板上添加顺序、内标 (IS) 添加，以及板中的样品混合。后，对使用离心的传统 PPT 和用 Captiva EMR-Lipid 净化后 PPT 的对比结果进行了详细讨论，包括时间、方法性能以及对仪器的影响。

前言蛋白质沉淀 (PPT) 已广泛用于 LC/MS/ MS 分析的生物体液样品前处理1 。将生物体液样品与 3–5 倍体积可与水混溶的溶剂（如乙腈 (ACN)、甲醇 (MeOH) 或二者的混合物）混合，来实现蛋白质的有效去除。有机溶剂的添加破坏了蛋白质的水化层，降低了蛋白质分子间的排斥力，显著降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀出来。之后，可通过离心或过滤去除沉淀，并将上清液用于分析。即使由于蛋白质结合或受蛋白质结合影响的分析物稳定性，导致某些目标分析物可能发生损失，PPT 方法学仍然提供了快速、简单、经济的样品前处理方法，适用于高通量样品分析。 Captiva EMR-Lipid 96 孔板可以进行孔内 PPT，然后进行高效过滤以去除沉淀。此外，EMR-Lipid 吸附剂可在样品过滤期间与基质中的脂类发生相互作用，得到更洁净的洗脱液，同时去除了蛋白质和脂类。本应用简报重点讨论了使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板的这一重要样品前处理技术的关键步骤。

沉淀溶剂与比例可与水混溶的有机溶剂通用于沉淀蛋白质，通常是 ACN、MeOH 或二者的混合物1 。之前的研究中对采用 ACN 或 MeOH 的 PPT 进行了全面对比2 。使用 ACN 进行 PPT 通常会产生大量黄色凝结沉淀，而 MeOH 通常会产生更细的白色凝结沉淀（图 1）。上清液的澄清度通常是 PPT 效率的良好指标，浑浊的上清液表明仍然存在未沉淀的蛋白质。图 1A 表明，使用 MeOH 和 ACN 的小沉淀比分别为 3:1 和 2:1 时，可以获得澄清的上清液。

图 1B 表明，样品在 10 °C 下储存 24 小时后，以 3:1 的比例使用 ACN 可获得澄清的上清液。结果清晰表明，ACN 可比 MeOH 实现更有效的蛋白质沉淀，如需实现有效的蛋白质去除，有必要将小沉淀比设为 3:1。然而，更大的沉淀比也会导致样品更多的稀释。因此，通常推荐采用 3:1–5:1 的沉淀比，在实现有效蛋白质去除的同时仍保持样品的适当稀释

沉淀溶剂的另一个考虑因素是目标分析物的溶剂萃取。ACN 和 MeOH 可对不同化合物表现出不同的萃取能力。在需要调节目标分析物的溶剂可萃取性时，可以添加少部分的 MeOH（通常为 5%–15%）。而需要了解的是，即使沉淀溶剂中如此少量的 MeOH，也会导致蛋白质沉淀呈现出不同的视觉效果（图 2A 和图 2B）。与沉淀溶剂混合的 MeOH 越多，沉淀就越细，过滤去除沉淀时所需的压力也就越大。鉴于 MeOH 的蛋白质沉淀效率低于 ACN，过量 MeOH 会对 PPT 效率产生不利影响。因此，建议沉淀溶剂中的 MeOH 含量不超过 15%。使用 ACN（或主要是 ACN）作为沉淀溶剂的第三点考虑因素应是易于通过过滤去除蛋白质沉淀。采用 ACN 的 PPT 可产生较大颗粒的蛋白质沉淀，这种沉淀不易堵塞滤芯/滤膜，可更轻松地过滤沉淀。采用 MeOH 的 PPT 可产生更多更细的沉淀，这种沉淀易于堵塞滤芯/滤膜，因此过滤时需要明显更大的压力。

为减少蛋白质结合，通常将甲酸 (FA) 或氢氧化铵 (NH4OH) 等添加剂加入沉淀溶剂中，其中 1% FA 是常用的添加剂。而在全血 PPT 中，应谨慎添加酸，因为酸可以提取出更多的血红蛋白颜色，PPT 后会得到棕色/红色上清液。图 2C 和图 2D 显示采用中性沉淀溶剂、酸化溶剂（含 1% FA）和碱性溶剂（含 1% NH4OH) 进行 PPT 后的上清液外观。酸化 PPT 的上清液呈深棕色/红色。因此，请仔细考虑或避免使用酸化沉淀溶剂来进行全血 PPT。

生物体液生物体液包括全血、血浆、血清、尿液和其他体液。全血、血浆和血清是富含蛋白质的主要血液基质。因此，在 LC/MS/MS 分析之前有效去除这些蛋白质至关重要。 • 全血是含有抗凝血剂的血液，不会分离为液体部分和血细胞 • 血清是无抗凝剂时与血细胞分离的顶层澄清液体部分，因此血清中不含纤维蛋白原 • 血浆是与血细胞分离的液体部分，含有纤维蛋白原在相同体积下，基质中的蛋白质含量遵循全血 > 血浆 > 血清，如 PPT 生成的蛋白质沉淀所示（图 3）。通常认为尿液和其他体液是低蛋白质含量基质，PPT 仍可广泛用于这类基质，但与血液基质相比，这类基质实现有效蛋白质去除的难度不大。因此，这类生物体液基质中采用的沉淀溶剂与沉淀比有更大的灵活性。通常，用于制备这类样品基质的 PPT 被称为稀释和上样。

Captiva EMR-Lipid 板上的孔内 PPT 高通量批处理中可自动进行 PPT；因此，96 孔板形式得到广泛采用。在过滤型沉淀去除中，孔内 PPT 有利于简化工作流程。而避免由沉淀造成的堵塞对过滤非常重要。Agilent Captiva 增强型脂质去除 EMR-Lipid (EMR-Lipid) 吸附剂可在蛋白质沉淀后，高选择性而有效地去除生物体液中的磷脂和其他脂类。这款产品同时采用了深度过滤机制的设计，可实现无堵塞的高效蛋白质沉淀过滤，从而可以使用孔内 PPT 并简化工作流程。

血液基质（特别是全血）是高粘度液体。之前建议将血清或血浆样品加入 EMRLipid 板的沉淀溶剂中3,4。而将这一方法应用于全血样品，就会出现问题。全血的高粘度使其容易立即沉降在底部，导致样品混合均匀性过低。一小部分未沉淀的全血可能会流经 EMR-Lipid 过滤柱，造成样品间的显著差异。有效混合有助于实现*的蛋白质沉淀5 。而对于 96 孔板中的全血样品，由于产生大量沉淀、沉淀堵塞枪头的高风险以及孔间交叉污染，使样品抽吸混合较为困难。

结论 PPT 因其简便性和适用性，广泛用于制备 LC/MS/MS 分析的生物体液样品。使用 96 孔板形式的批处理提高了样品前处理效率，而得到广泛使用。孔内 PPT + Captiva EMR-Lipid 净化技术与传统 PPT 相比具有许多优势，包括简化的工作流程、蛋白质和脂类的同时去除，更高的方法可靠性、高质量数据以及对检测仪器更少的影响。根据分析要求，使用合适的沉淀溶剂类型、比例和添加剂至关重要。合适的溶剂和样品添加顺序（样品、IS 和沉淀溶剂）是达到有效均匀混合并防止绕过样品的重要因素。与传统的单个样品处理相比，96 孔板上的批处理通常具有更高的交叉污染风险；因此，适当的移液和混合十分关键。