Q Exactive 高分辨质谱平台对培非格司亭及其生物类似药进行对比

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1、前沿：粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是肿瘤病人化疗后提升白细胞的标准疗法，其 中重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)已经广泛应用于化疗 和放疗引起的白细胞数减少症[1]。成熟的内源性人粒细胞集落刺 激因子（G-CSF)由174个氨基酸构成，分子量为18-20kDa。 利 用基因工程技术，Amgen公司在1991年上市了大肠杆菌发酵的 短效版G-CSF非格司亭（Neupogen），2001年上市了长效版 G-CSF培非格司亭（Peglgrastim，Neulasta）。Neupogen和 Neulasta两者的区别在于长效版使用了PEG的修饰技术，使CSF 的分子量和体积变大，延长了半衰期，从而把化疗周期内的注 射次数从7-10次减少到1次注射，增加了临床使用的便利[2]

PEG修饰使蛋白相邻电荷态之间叠加非常严重[3,4]，为了降低蛋 白电荷数，需要在色谱流动相中使用三氟yi酸（TFA），取代 常用的甲酸（FA），使样品m/z向高质量端移动，从而减少相 邻电荷态之间的信号叠加；在质谱中PEG修饰的蛋白会发生去 PEG化，为了避免此种情况，要在柱后添加三乙基胺（TEA） ；TEA同时也可以起到降低蛋白电荷态的作用[5]。

 实验方法 仪器及试剂 • Thermo™ Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer • Thermo™ Ulimate3000 3400RS UHPLC system • Thermo Scientic™ Hypersil GOLD™ C18 column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm• Thermo Scientic™ Acetonitrile, UHPLC-MS grade Thermo Scientic™ Pierce™ Triuoroacetic Acid, Sequencing grade Sigma-Aldrich Triethylamine, ≥99%

 实验样品 总共两个PEG-rhG-CSF类样品，一个是原研药Neulasta，另一 个是仿制药Biosimilar。样品均为无色澄清溶液。 样品前处理步骤 以Millipore Water将两个样品分别稀释至1mg/mL后上LC-MS平 台分析，测定其完整分子量。

 实验方法设置 液相色谱实验条件： 流动相：A(50%ACN+0.1%TFA), B(95%ACN+0.1%TFA) ； 柱温：50℃； 流速：0.3mL/min; Postcolumn-addition: 400mM TEA in water, 5μL/min; 上样量：1μg. 色谱梯度如表1所示；为减少TEA及TFA对质谱系统的污 染，3min之后的组分均通过质谱自带六通阀切入废液。

 数据处理软件 使用Thermo Scientic BioPharma Finder 3.2软件进行完整分子 量分析，实验参数如图1所示。

 图3展示了Neulasta样品在分辨率15000/120000下的解卷积 结果。分辨率=15000时，总共检测到181个组分。由图中可 见，随分辨率增高，相邻组分之间得到更好分离；当分辨率为 15000时，对于nPEG=483的组分，其理论与实测分子量偏差 为-2.26Da；当分辨率为120000时，对于nPEG=483的组分， 其理论与实测分子量偏差为0.35Da。可见随着分辨率的增高， 可将分子量相近的组分分离开（上右图中红线与蓝线所示的两 个组分），从而提高分子量测定的准确度。

 同样由于PEG修饰，导致样品高度复杂。对其进行解卷积处理 （图5），在15000分辨率下共检测到141个组分，同样呈正态 分布，选取局部区域放大观察，各个组分之间均实现了基线分 离（局部放大图）

 使用BioPharma Finder软件对原研药和类似药进行镜像图对 比，可见相比于原研药，生物类似药的分布整体向高质量端 平移，说明修饰的PEG链分布不同。根据前述公式分别计算两 个样品的Mn，Mm和PD，结果如表3所示。由表3中可以明显 看出，由于修饰PEG链的分布不同，导致原研药和类似药的 Mn ，Mm和PD均有差异。

 结论 ：在本文的研究中，我们在赛默飞Q Exactive HF-X平台上对PEG修饰的 Neulasta及其生物类似药分子量进行了测定，并计算了其数均 分子量、质均分子量和PEG多分散性，以评估类似药与原研药 的相似程度。从结果中可以看出，相比于原研药，生物类似药 的分子量整体向高质量端平移，表明PEG修饰链的分布有所差 异；得益于Orbitrap高分辨质谱平台的优异性能，对于高度复杂 的PEG修饰样品，仍然能够实现相邻质谱峰间的基线分离，从 而准确测得其分子量用以评估PEG修饰链的分布，从而对产品 进行评估。

参考文献 1 Lyman GH, Dale DC, Culakova E, Poniewierski MS, Wolff DA, Kuderer NM, Huang M, Crawford J. Annals of Oncology. 24 (10): 2475–84. 2 Harris, J. M.; Chess, R. B. Nat. Rev. Drug Discovery 2003, 2, 214−21. 3 Mann, M.; Meng, C. K.; Fenn, J. B. Anal. Chem. 1989, 61, 1702−1708. 4 Trimpin, S.; Plasencia, M.; Isailovic, D.; Clemmer, D. E. Anal. Chem. 2007, 79, 7965−74. 5 Huang, L. H.; Gough, P. C.; DeFelippis, M. R. Anal. Chem. 2009, 81, 567−577.