基于Orbitrap ID-X技术的中药柴胡体外肠内菌代谢物分析

前言：传统中药以口服用药为主，其化学成分受胃肠道酸碱性、肠道微生 物及代谢酶等影响常发生转化，使其生物利用度降低，体内除中药 原形成分外，还可能有大量代谢产物的存在，这些体内吸收化学 成分是阐明中药发挥药效机制的直接物质基础。要想揭示中药体内 药效物质，代谢产物研究是*的重要组成部分，尤其是苷类 及其他结构易转化的化学成分（如萜类等），其生物利用度较低， 在体内主要以代谢产物的形式存在，在此种情况下，代谢产物可能 是药效的主要来源[1]。然而，由于中药成分的代谢规律不明 确、代谢产物含量低难以鉴定等原因，大大制约了中药体内药效物 质基础的研究。 

为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱 对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代 谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统LC Q-TOF MS高分辨质谱的DDA数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级 质谱图用于结构鉴定。新一代赛默飞Orbitrap ID-X Tribrid三合一质谱仪由 于具有Acquire X智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及 包含列表，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分 析。

柴胡Bupleuri Radix为伞形科植物柴胡（又称北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升举阳气之功效[2]。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油 类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保 肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用[3-5]。近年来，液相色谱-质谱联 用技术（LC-MS）的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢研究[6,7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结 果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。

本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有AcquireX采集功能 的Orbitrap ID-X Tribrid MS技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先 用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用 Compound Discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数 据进行解析，终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临 床合理应用奠定理论基础。

实验方法

1. 样品前处理 取柴胡粉末约20g，加入150mL 70%乙醇置于圆底烧瓶中，加热 回流提取60min，离心后取上清液，抽滤后滤液旋转蒸发浓缩至20 mL，冻干保存。肠内菌液的收集与制备参考文献[8]，培养时间分 别为0小时（对照组），1小时和24小时作为实验组样品。用等量 的磷酸钾缓冲溶液代替底物溶液，其它操作同实验组，此作为空白 组。

2. 色谱方法 超高效液相UHPLC（Dionex Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱 温箱，和二元泵组成。色谱柱为Hypersil Gold C18（2.1 mm × 100 mm，1.9μm，Thermo Fisher Scientic）；流动相为0.1％甲酸水 （A）和乙腈100%（B）。流速为0.3mL / min，进样体积3uL， 柱温40℃；采用梯度洗脱：起始，5%（B）；0-1min (5%-5％B); 1-5min (5%-50％B); 5-19min (50%-98％B); 19-23min (98%-98％B);23.1-25min (5% B)。

3. 质谱条件 仪器：Thermo Scientic Orbitrap ID-X Tribrid 三合一质谱仪，利用 AcquireX 智能数据采集模式获得HR MS/MS，±ESI 检测模式，离子 源参数如下：Spray Voltage ±3.5KV; Sheath Gas Pressure: 40arb; Aux Gas Pressure: 10arb; Capillary Temperature: 275℃; Heater Temperature: 350℃。质谱扫描参数：扫描范围 (Scan range)（m/z） ：120-1500；Full Mass分辨率(Orbitrap resolution)：120000，MS/ MS分辨率：30000；使用Xcalibur 4.1和 Compound Discoverer 3.0 化学工作站进行数据处理

实验结果和讨论

1. Acquire X智能化数据采集模式 中药代谢物由于其成分的高度复杂性，而且代谢物检测容易受到基 质的干扰，传统的DDA模式很难采集到低含量代谢物的二级质谱图 进行定性分析，Orbitrap ID-X中的Acquire X智能化数据采集模式可 以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分 析。AcquireX采集数据过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生 成排除列表，排除背景离子；柴胡体外肠内菌孵育样品用于生成包 含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时更新采集方法。如 某一离子已经触发了MS/MS碎片，在下一针采集将自动加入到排 除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于MS/MS离子的 触发（如图1所示）。

 2. 数据处理流程 数据处理采用Compound Discoverer (简称CD)的工作流程Metabolism Expected w FISh and Unknown w MDF Pattern and Compound Class Scoring进行代谢物的鉴定。实现自动峰提取、空白扣除、分 子式生成，代谢物查找及鉴定等步骤。软件中嵌入了常见的Ⅰ相代 谢和Ⅲ相代谢反应，可以用于已经代谢物的快速查找和鉴定工作。 此外上述工作流程还集合了MDF，FISh Trace，和Pattern Trace 多 种算法，可以用于未知代谢物的查找和鉴定（如图2）。在对代谢 物完成峰提取后，CD可以将代谢物的二级质谱图与母药的二级质 谱图进行镜像比对，帮助进行代谢位点确定。

3. Fragment Ion Search (FISh) 自动辅助进行代谢位点确认 选择柴胡中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷A和绿原酸为母药，看这 些物质在孵育基质样品中的代谢情况。下图3a所示为柴胡皂苷A的 代谢物Dehydration+Dehydration+Stearyl Conjugation的二级质谱 图，绿色颜色标记的碎片为代谢物和母药相同的碎片，蓝色颜色标 记的碎片为代谢物的变化位点，由特征性碎片m/z 357.27844可知 此未知代谢物位点应在葡糖糖上。下图3b所示为绿原酸的代谢物 Dehydration+Dehydration+Acetylation的二级质谱图，由特征性碎 片m/z 169.01262可知此未知代谢物位点应发生在奎尼酸上。

 结论：本实验采用Orbitrap ID-X Tribrid MS高分辨液质联用技术，结合 Compound Discoverer软件中的代谢物分析工作流程，对中药柴胡 体外肠内菌代谢物进行了快速准确的分析。Compound Discoverer 内置I 相+II相代谢途径，针对已知和未知代谢物开采用质量亏损过 滤（MDF），碎片离子搜索策略（FISh），特征同位素，共有碎片 检索等方式，寻找代谢物；同时软件提供多种统计学工具，通过不 同给药时间点或不同处理方式统计学差异，确证代谢物。选择柴胡 中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷A和绿原酸为母药，在孵育基质样 品中柴胡皂苷A正离子模式共鉴定出14种可能的代谢物，负离子模 式鉴定出11种可能的代谢物；绿原酸共鉴定出5种可能的代谢物。

参考文献 [1] 邱峰, 浅谈中药成分体内代谢研究, 药学研究杂志，2010, 37, 321-327. [2] 中国药典[S]. 一部. 2015. [3] Y. Motoo and N. Sawabu, “Antitumor effects of saikosaponins, baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines,” Cancer Letters, 1994, 86, 91–95. [4] M. S. Idris-Usman, “Antinociceptive and antipyretic properties of the pharmaceutical herbal preparation, Radix bupleuri in rats,” Journal of Medicinal Plants Research, 2010, 4, 659–663. [5] B. P. Bermejo, M. J. A. Martinez, A. M. S. Sen et al., “In vivo and in vitro antiinammatory activity of saikosaponins,” Life Sciences, 1998, 63, 1147–1156. [6] G.Q Liu, Y.T, G. Li, L. Xu, R. Song, Z.J Zhang, Metabolism of Saikosaponin a in Rats: Diverse Oxidations on the Aglycone Moiety in Liver and Intestine in Addition to Hydrolysis of Glycosidic Bonds, Drug Metab Dispos, 2013, 41, 622–633. [7] Pei Yu, Hongcong Qiu, Min Wang, Yuan Tian, Zunjian Zhang, Rui Song. In vitro metabolism study of saikosaponin d and its derivatives in rat liver microsomes, Xenobiotica, 2017, 47, 11-19. [8] 冯桂芳, 刘舒, 皮子凤, 宋凤瑞, 刘志强, 基于超高效液相色谱-质 谱联用技术的人参皂苷体外I相代谢研究, 质谱学报, 2017,