应用Ultivo LC/TQ对血浆中的褪黑素进行常规定量研究

摘要：本应用简报介绍了使用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱与配备 ESI 离子源的 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 联用系统对褪黑素 (MEL) 进行的定量研究。对于加标至血浆中的褪黑素-D4 (MEL-D4)，经优化的 LC/MS 方法获得了 10 pg/mL 的定量下限 (LLOQ)。这种高灵敏度的快速研究方法可以定量分析通过简单的蛋白质沉淀方法前处理的复杂人血浆提取物中的低浓度内源性 MEL。

前言 ：MEL 是一种内源性激素和强效的神经递质，帮助调节生理节律和睡眠，通常用于治疗失眠等睡眠障碍。有关药代动力学和内源性 MEL 产生的研究需要能够测量低分布浓度的 MEL 的分析技术，该浓度随个体和一天中时间的变化而变化。由于 LC/MS/MS 方法比传统的放射免疫分析具有更高的特异性，该方法已经得到广泛应用，目前已经开发了 LC/MS/MS 方法以满足对血浆中 MEL 进行高灵敏度和高特异性定量的生物分析要求。本应用简报表明 1260 Infinity II Prime 液相色谱与配备 ESI 离子源的 Ultivo LC/TQ 的联用系统可获得精确定量人血浆中的 MEL 所需的分析灵敏度。

实验部分：试剂与化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 或 LC/MS 级。乙腈和甲醇购自 Honeywell (Morristown, NJ, USA)。超纯水产自配备 LC - Pa k Polisher 和 0.22 µm 膜式终端过滤器滤芯的 Milli-Q Integral 系统 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。LC/MS 级甲酸购自 Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)。氟化铵和 LC/MS 级甲酸铵购自 Millipore Sigma (St. Louis, MO, USA)。MEL (≥ 98%) 和 MEL-D4（≥ 98% MEL，≥ 99% 氘代形式 D1–D4）购自 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)。NIST SRM 1950 人血浆购自 Millipore Sigma。柠檬酸盐人血浆也购自 Millipore Sigma，仅用于回收率研究。对于血浆中 MEL-D4 的 LLOQ 测定，采用血浆提取物配制 13 个校准浓度，浓度范围为 10 pg/mL 至 100 ng/mL。根据制造商对氘代 MEL (D1–D4) 的建议，首先通过与标准曲线相关的定量离子对（237.1 & 178.1 与 233.1 & 174.1）峰强度比，根据精确量的未标记 MEL 对此标准储备混合液进行定量。我们并未在 MEL-D4 中观察到大量的 D0 形式。在纯溶剂中分析 100 ng/mL MEL-D4 时没有明显的未标记 MEL MRM 信号 (< 0.1%) 可以证明这一点。

样品前处理：对于所有实验，血浆的蛋白质沉淀步骤如下：将 EDTA (0.5 mol/L, 50 µL) 加入到 200 µL 于冰上保存的血浆等分试样中，短暂涡旋混合。加入乙腈 (750 µL)，涡旋 30 秒，在冰上孵育 20 分钟，然后在 4 °C 下以 16000 × g 的速度离心 10 分钟以沉淀蛋白质。将有机上清液 (800 µL) 转移至 2 mL 棕色 LC/MS 样品瓶中，利用真空浓缩仪对其进行干燥。将提取物复溶于 100 µL 甲醇，超声水浴处理 5 分钟，然后转移至 250 µL 玻璃自动进样器样品瓶内插管中，用于 LC/MS 分析。此外，需使用重组血浆配制校准曲线样品。 MEL 是一种光敏化合物，注意尽量减少光照。对于回收率评估，在提取之前（预加标），向四个血浆重复试样中加标 MT-D4，加标浓度为 1 ng/mL。将上述重复试样与后加标的四个血浆重复试样进行比较，计算回收率。为了测定内源性 MEL，向一份血浆等分试样中预加标 MT-D4，加标浓度为 10 ng/mL，以校正样品前处理中的损失，实现准确定量。

仪器： Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱仪： • Agilent 1260 Infinity II Prime 全能泵 (G7104C) • Agilent 1260 Infinity II Multisampler，配备冷却装置 (G7167A) • Agilent 1260 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116A) • Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统 • 安捷伦电喷雾离子源 (G1948B)

结论：本应用简报证明 Ultivo-ESI 具有与标准 Ultivo 系统相媲美的出色性能。它实现了定量研究血浆中低 ppt 级褪黑素所需的分析灵敏度。此系统也是一款经济适用的仪器，能够定量血浆中低浓度的内源性褪黑素，并且仅需极少的样品前处理。