气相色谱-质谱法同时检测奶及奶制品中的3种雌激素残留

【概述】

雌激素是由卵巢分泌的一类类固醇激素，其通过食物链进入人体后会扰乱体内激素平衡，影响生殖系统、神经系统，诱发乳腺癌、卵巢癌等疾病[1-2]。

1996年欧盟明令禁止使用具有促生长作用的激素（Council Directive 96/22/EC, 96/23/EC）。《中华人民共和国农业部公告第235号》也规定了雌激素为禁用药物。但是食品中微量雌激素残留问题依然存在，为了有效地监督动物源性食品的质量，开发具有高灵敏、高通量检测雌激素残留的确证分析方法是非常必要的。

目前，关于动物源性食品中雌激素残留的测定方法已有综述报道［3-4］，主要有液相色谱法、液质联用法（LC-MS）和气质联用法（GC-MS）。但是，关于牛奶和奶粉中雌激素的文献报道较少［5-8］。奶及奶制品基质成分复杂，激素残留量低，而且部分激素化学结构相似，影响分析准确性，因此需要建立快速、准确的方法来解决奶及奶制品中的雌激素检测问题。本工作旨在建立一种GC-MS法快速、灵敏、准确测定奶及奶制品中炔雌醇、17β－雌二醇和雌三醇的残留量。

【实验/设备条件】

色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；

柱温：60℃（1 min），

          20℃/min到200℃（3 min），

          20℃/min到260℃（5 min），

          20℃/min到280℃（10 min）；

进样模式：大体积进样；进样量：5 µL；

进样口温度：50℃（0.05 min），

                    14.5℃/sec到80℃（1 min）（分流出口流量20mL/min），

                    14.5℃/sec到260℃（15 min）；

载气：氦气（99.999%），恒流模式，1 mL/min；

质谱离子源温度：300℃，传输线温度：300℃；

扫描模式：选择离子监测模式，17β－雌二醇：

285,286,416*,417；炔雌醇：285,300,425*,440；

雌三醇：311,345,386,504*

【样品提取】

提取

A）液态样品准确称取10g牛奶样品，于50mL离心管中，加乙腈5mL、乙酸乙酯15mL，漩涡振荡3min，10000r/min离心10min，收集上清液于40℃水浴旋转蒸发至近干，用1mol/L氢氧化钠溶液6mL分三次溶解，转至另一50mL离心管中，加正己烷20mL漩涡振荡1min，10000r/min离心10min，收集下层提取液，用5mol/L盐酸溶液调pH至5.0-5.2，备用。

B）固态样品准确称取2.0g奶粉样品，于50mL离心管中，加乙酸乙酯15mL，漩涡振荡3min，10000r/min离10min，收集上清液于40℃水浴旋转蒸发至近干，用1mol/L氢氧化钠溶液6mL分三次溶解，转至另一50mL离心管中，加正己烷20mL漩涡振荡1min，10000r/min离心10min，收集下层提取液，用5mol/L盐酸溶液调pH至5.0-5.2，备用。

净化

   C18柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取备用液过柱，用水5mL淋洗，抽干，用甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，加正己烷1mL，振荡，弃去正己烷层，重复两次，甲醇层于40℃水浴氮气吹干。

衍生

  残余物加吡啶和衍生化试剂各100µL溶解，混匀，封口，残余物加吡啶和衍生化试剂各100µL溶解，混匀，封口，过0.22µm滤膜，供气相色谱质谱测定。

【实验/操作方法】

本方法是将样品中的雌激素用乙酸乙酯提取，固相萃取的方法净化，衍生后用气相色谱-质谱进行定性、定量。该方法定量准确，灵敏度高，重现性好，能够满足目前奶及奶制品中雌激素检测的需要。

【实验结果/结论】

衍生条件的优化

乙酸乙酯、甲苯和正己烷等有机溶剂在衍生反应的过程中，都能部分地转化炔雌醇的衍生物为雌酮的衍生物，从而造成对样品结果的错误估计。吡啶是较合适的反应介质，不会有衍生产物之间的相互转化。

仪器分析方法优化

以全扫描的方式对3种雌激素的衍生产物进行测定，得到其质谱图（图1）。根据全扫描质谱图和保留时间，选择合适的定性和定量的特征目标监测离子。测定时，可根据标准物和待测物的定量离子流图中的峰面积，外标法定量。确证时，可根据碎片离子及其丰度比作为其阳性判别的依据。在选定的色谱条件下，标准品的色谱图见图2。

图1.雌二醇、炔雌醇、雌三醇（自上而下）的质谱图

图2. 200ng/mL雌激素标准溶液衍生产物色谱图

线性关系及测定低限

准确移取适量雌激素混合标准中间液，分别用甲醇稀释配制得到浓度为5、10、20、50、100、200ng/L的标准工作液，各取1mL氮气吹干，加入衍生试剂和吡啶，按上述方法进行衍生，供气相色谱质谱测定。以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图3。方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法牛奶的测定低限为0.5µg/kg，奶粉的测定低限为2.0µg/kg。

图3.三种雌激素的线性情况

回收率及精密度实验

用标准添加法，在空白牛奶和奶粉样品中，添加雌激素混合标准溶液，做加标回收实验，按上述方法进行提取、净化、衍生和测定，牛奶样品添加浓度为1µg/kg和2µg/kg两个水平，奶粉样品添加水平为10µg/kg，各做3个平行，空白样品、添加谱图见图4，结果见表1。

图4.样品空白和样品加标谱图（自上而下依次为空白样品、样品加标、标准溶液）

表1.空白样品添加实验回收率和精密度

结论

样品中的雌激素经乙酸乙酯提取后，经C18固相萃取小柱净化，衍生后采用赛默飞世尔新型的气相色谱质谱仪检测和确证，外标法定量。结果表明，三种雌激素的平均回收率为61.7-84.6%，3次平行测定的RSD值≤14.1%，方法测定低限为0.5ng/g。此法灵敏度高，能够满足牛奶和奶粉中雌激素的残留分析要求。

【仪器/耗材清单】

仪器

Trace1310-ISQ气相色谱质谱联用仪，配EI源（ThermoScientific）；AS1310自动进样器（Thermo Scientific）

恒温干燥箱、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪、旋转蒸发器、固相萃取仪（Thermo Scientific）

耗材

色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）（Thermo Scientific,PN: 26098-1420）

C18 SPE柱，500mg，3mL（Thermo Scientific）

试剂与标准品

炔雌醇、17β－雌二醇和雌三醇标准品：含量≥99%；

氢氧化钠：优级纯；盐酸：优级纯；无水硫酸钠：优级纯；

正己烷、乙酸乙酯、乙腈、吡啶：

衍生试剂：BSTFA+TMCS(99+1)