基于CSR技术和内标法GC-MS 测定白酒中氨基甲酸乙酯含量

【概述】

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)，又叫乌拉坦（Urethane），是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病。人类从膳食中摄入的氨基甲酸乙酯，主要来自发酵食物和饮品，其中酒*品是已知的氨基甲酸乙酯主要来源。

调查显示，如果饮用氨基甲酸乙酯含量超过30×10-6g/kg的酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福尼亚环保机构的一项统计数据得知，假设每个人的患癌症的机率为1×10-5，推断氨基甲酸乙酯的摄入量大约为0.7μg/d。因此黄酒中氨基甲酸乙酯是危害人类健康的一个不可忽视的因素。上已就不同酒*品的氨基甲酸乙酯含量进行了广泛研究，一些国家已制定出酒*品的氨基甲酸乙酯高*，如加拿大是多种酒*品制订氨基甲酸乙酯高*的国家，由30μg/L (葡萄酒)至400μg/L(水果白兰地)不等。美国、日本、韩国等亦相继制订出部分酒的氨基甲酸乙酯高限值。

【实验/设备条件】

1.色谱柱：TG-WAXMS  30 m×0.25 mm×0.25μm石英毛细管柱；

2.进样口温度：220℃；

3.升温程序：初始温度为50℃，保持1min，以8℃/min

升至180℃，保持10min；

4.载气：氦气（纯度≥99.999%）；

5.载气流速：1.0mL/min；

6.进样量：13μL；

7.进样方式：不分流进样。

8.离子源：EI源；

9.离子源温度：250℃；

10.传输线温度：280℃；

11.采集模式：SIM模式(44,62,74,89,64,76)。

【样品提取】

标准溶液的制备

1）称取0.0161g（至0.0001g）氨基甲酸乙酯标准品（纯度为98.5%），用甲醇溶剂、定容至10mL，此时

溶液浓度为1585.85μg/mL；

2）称取0.0334g（至0.0001g）D5-氨基甲酸乙酯标准品（纯度为98.7%），用甲醇溶剂、定容至10mL，此时溶液浓度为3296.58μg/mL；

3）100μg/mL氨基甲酸乙酯标准品溶液：取63μL（1）溶液，加937μL甲醇，定容至1mL，混匀。

4）100μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取30μL（2）溶液，加970μL甲醇，定容至1mL，混匀。

5）2μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取20μL（4）溶液，加980μL甲醇，定容至1mL，混匀。

6）10μg/mL氨基甲酸乙酯标准品溶液：取100μL（3）溶液，加900μL甲醇，定容至1mL，混匀。

7）0.5μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取50μL（6）溶液，加950μL甲醇，定容至1mL，混匀。

标准工作曲线溶液的制备

分别准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（0.5μg/mL）20、50、100、200、400μL和氨基甲酸乙酯标准中间（10.0μg/mL）40、100μL于进样小瓶中，各加2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100μL，用甲醇定容至1mL，得到10.0、25.0、50.0、100、200、400、1000ng/mL的标准曲线工作溶液，现配现用，供GC-MS分析。

样品制备

取100μL样品（95%乙醇），加入2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100μL，用甲醇定容至1mL摇匀待测。

【实验/操作方法】

本文按照GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了ISQ-LT GC-MS结合CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。

【实验结果/结论】

1采用CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯

1.1 CSR大体积进样原理介绍

溶剂浓缩大体积进样技术（Concurrent Solvent Recondensation,简称CSR），即在进样口和分析柱间连接一段空的预柱，且衬管中装填玻璃棉，采用传统的分流不分流进样口，进样口处于恒定的较高温度，自动进样器插入汽化室5 mm，保持针头部分温度较低，快速注入样品。样品以带状液体的状态离开注射器，被收集在衬管底部的少量玻璃棉上，开始缓慢汽化。由于衬管是一个密闭体系，蒸汽体积迅速膨胀，取代和压缩载气，使得衬管内压力迅速增大，而载气阻止了溶剂蒸汽从汽化室溢出，从而产生了“压力涌浪”效应，迫使溶剂蒸汽转移到低温的预柱上。溶剂蒸汽在柱头上冷凝形成液膜，进一步加速了蒸汽的转移，此时溶剂汽化和冷凝同时发生，使得进样体积不再受汽化体积的限制，从而实现大体积进样，预柱起承载样品的作用。图1为CSR基本原理图解，图2为CSR进样过程。

图1. CSR基本原理图解

图2. CSR进样过程

1.2 CSR大体积进样技术特点

PTV进样虽然进样体积可高达250μL，但是在溶剂蒸发的过程中会造成低沸点化合物的损失；而OCI进样虽然不会造成低沸点化合物损失，但由于样品溶液直接注入到色谱柱中，很容易造成色谱柱的污染，导致某些化合物响应偏低、且影响分离。相比，CSR技术更具有*性，具备以下三个特点。

（1）特点一：显著提高检测灵敏度

CSR大进样体积为50μL，能显著提高检测灵敏度。例如：CSR大体积进样气相色谱质谱中的应用，如图3所示，进样量为1、2、3、4、5μL时所得的结果比较，从图中可以得出，随着进样体积的增加，响应值几乎呈线性倍数增加，充分表明增加进样量可以显著提高检测灵敏度。

图3.不同进样体积结果

（2）特点二：分析高、低沸点化合物无歧视

如图4所示，以正己烷为溶剂，不同环数烷烃的大体积进样分析，进样体积35μL。从图中可以看出比正己烷溶剂多两个碳的化合物C8，并未随溶剂蒸发损失，且高沸点的C40具有较好的响应及分析精密度，进一步证明了CSR对低沸点和高沸点化合物均无歧视效应。

图4.低、高沸点化合物无歧视

（3）特点三：简化前处理过程，避免低沸点化合物浓缩时有损失

如图5所示，在环境水体中PAHs的分析，一般需要浓缩1000倍，进样量为1μL，采用液液萃取和SPE小柱富集两种方式均消耗大量溶剂，且费时，在氮吹浓缩过程中容易造成低沸点PAHs的损失。因此可以采用类似液液微萃取的方式，只需1mL有机溶剂，20mL水样，无需氮吹浓缩，萃取后可直接进样分析，进样量为50μL，可达到相同效果，甚至更好，既可以大大减少样品前处理过程，并避免低沸点化合物的损失。同样，在农残分析过程中，如JIA胺磷等低沸点农药在旋转蒸发和氮吹浓缩过程中也容易损失一部分，从而造成结果不准确，因此可以采用CSR技术来解决这一问题。

图5.简化前处理过程

2典型色谱图

图6. std200μg/L

图7. 95%乙醇样品

其中样品中氨基甲酸乙酯平行测试结果为：27.15和23.41 ng/mL，平均值为25.125 ng/mL。

3检出限及线性相关系数R2

连续5天每天的校准曲线，相关系数R2范围0.9997～0.9999。

表1.检出限及线性相关系数R2

4响应值重复性

（1）日内重复性：将25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液（含同位素内标）一天内连续进样6次，计算TIC峰面积RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（2）日间重复性：将上述标准溶液6天内每天进样3次（每次间隔应≥2小时），计算TIC峰面积RSD%，分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（3）结果表明：目标峰和内标峰响应值日间重复性分别为2.74%、4.20%；日内重复性分别为2.55 %、2.89%，重复性良好。

表2.响应值重复性

5保留时间重复性

（1）日内重复性：将25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液

（含同位素内标）一天内连续进样6次，计算目标峰保留时间RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（2）日间重复性：将上述标准溶液6天内每天进样3次（每次间隔应≥2小时），计算目标峰保留时间RSD%，分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（3）结果表明：目标峰和内标峰保留时间日间重复性为0.00、日内重复性为0.06%，重复性良好。

表3.保留时间重复性

6系统抗污染能力

使用标准中规定的校准曲线大浓度标样（1 mg/mL），连续进样分析20次，报告响应值重复性RSD%，次和

后一次响应值之差的值与平均响应值的比值。表4所示，系统抗污染能力目标峰为0.02、RSD为3.44%；内标峰为

0.03、RSD为3.05%，系统抗污染能力强。

表4.系统抗污染能力

结论

按照GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了ISQ-LT GC-MS结合CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，进样量为13μL，考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。实验结果表明：在10.0～1000ng/mL浓度范围内，相关系数R2范围0.9997～0.9999，线性良好；检出限为0.033 ng/mL；响应值日间日内重复性2.55～4.20%

之间；保留时间日间日内重复性0.00～0.06%之间；系统抗污染能力目标峰为0.02，内标峰为0.03，结果良好，同时

CSR大体积进样技术可以提高检出限和灵敏度，该方法满足分析检测的要求。

【仪器/耗材清单】

仪器

Thermo ScientificTM ISQ单四极杆气质联用仪，包括：

-TRACE 1310气相色谱，配分流不分流进样口

-ISQ LT单四极杆质谱

- AS1310自动进样器

Thermo ScientificTM TraceFinder 3.2.512.0数据处理系统统