应用液相色谱串联质谱系统检测人血清中 9 种水溶性维生素含量

本文使用液相色谱串联质谱系统，建立 了人血清/血浆中 9 种水溶性维生素的定量检测方法，并依据相关指导原则完成了部分方 法学验证。实验结果表明，该方法在检测人血清中的盐酸硫胺素 (VB1)、核黄素 (VB2)、 烟酸 (VB3-COOH)、烟酰胺 (VB3-NH3)、泛酸 (VB5)、4-吡哆酸 (VB6-COOH)、生物素 (VB7)、5-甲基四氢叶酸 (VB9-5-MeTHF)、甲基丙二酸 (VB12) 时，灵敏度较好；在人血清 基质中可报告浓度范围分别能够到达 1.0–100 ng/mL (VB1)，0.5–50 ng/mL (VB2\VB3- COOH\VB3-NH3)，5–500 ng/mL (VB5)，1.0–100 ng/mL (VB6\VB9)，0.25–25 ng/mL (VB7)，0.1–10 ng/mL (VB12)，线性相关系数均大于 0.990，线性准确度均在 80%–120% 以内；检测稳定性及准确性良好。综上所述，该方法分析速度快、稳定性和准确度好，适 用于血清中这 9 种水溶性维生素的定量分析。 注：以下在提到 9 种水溶性维生素的名称时均使用英文缩写。

实验部分 仪器与试剂 Infinity LC Clinical Edition/Triple Quad MS 液相色谱串联质谱系统 二元泵、真空脱气机、自动进样器、恒温器、柱温箱；质谱系统 为三重四极杆质谱仪；并配备 MassHunter Workstation 采集软件 （发布版本号 B.08）、MassHunter Workstation 定性分析和定量 分析软件（发布版本号 B.07）。 样品前处理设备 分析天平、多样品氮吹仪、低温离心机（离心力 ≥ 12000×g）、 旋涡混合器、移液枪等。 标准品及试剂 VB1 标准品、VB2 标准品、VB3-COOH 标准品、VB3-NH3 标准 品、VB5 标准品、VB6 标准品、VB7 标准品、VB9-5-MeTHF 标准 品、VB12 标准品；及对应的内标储备液（1 mg/mL 的 MeOH 溶 液或 100 μg/mL 的 MeOH 溶液）购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。空白血清购自 Golden West Biologicals, Inc。其它试剂和溶 剂均为 HPLC 或分析纯级别，包括甲醇、乙酸铵、超纯水。

溶液配制及样品前处理 标准品工作溶液配制：用甲醇分别配制浓度为 10 mg/mL 的 VB1、VB2、VB3（烟酸）、VB3（烟酰胺），VB5、VB6、VB7、 VB9（五甲基四氢叶酸）、VB12（甲基丙二酸）单标储备液。准 确移取该单标溶液适量，用水混合溶液，将其稀释成如下表 2-1 所示浓度的二级混标储备液。

同位素内标溶液的配制 (300 ng/mL) 配制：用甲醇分别配制浓度 为 300 µg/mL 的以上 9 种化合物的内标储备液，再用甲醇配制浓 度为 300 ng/mL 的内标混合工作液，–20 ºC 下避光保存，备用。 样品前处理方法：准确吸取标准曲线工作溶液、人血清样品 100 µL 于 1.5 mL 离心管内，加入 300 µL 加内标混匀后的甲醇试 剂，盖紧盖子，涡旋震荡 5 min，样品振荡完成后置于台式高速冷 冻离心机内，在 4 ºC 条件下以 13000 rpm 离心 5 min，冷冻离心 结束后，吸取全部上清液于干净的 1.5 mL 离心管，氮气吹干。吹 干结束后，移取 100 µL 超纯水于离心管内，涡旋振荡 1 min，在 4 ºC 条件下以 13000 rpm 离心 5 min，移取 85 µL 上层澄清溶液进 样分析。

结论 本简报应用安捷伦 Infinity LC Clinical Edition/Triple Quad MS 液相色谱串联质谱系统，建立了人血清中 9 种水溶性维生素的定 量检测方法，并进行了简要的方法学验证。实验结果表明，该 方法灵敏度、稳定性和准确度好，适用于盐酸硫胺素 (VB1)、 核黄素 (VB2)、烟酸 (VB3-COOH)、烟酰胺 (VB3-NH3)、泛酸 (VB5)、4-吡哆酸 (VB6-COOH)、生物素 (VB7)、5-甲基四氢叶酸 (VB9-5-MeTHF)、甲基丙二酸 (VB12) 的定量分析。但因方法学验 证不够全面，在该方案的实际应用时，应根据相关指导原则进行 更加详尽完整的方法学验证，并根据验证结果进一步优化，以求 使该方案更加准确稳健。