采用三重四极杆 LC-MS 系统定量分析宿主细胞蛋白质杂质

本应用介绍了 mAb 产品中亚 ppm 宿主细胞蛋白质杂质的定量分析方法。本工 作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台、Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统和 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统。

宿主细胞蛋白 (HCP) 杂质是低浓度的蛋 白质杂质，来源于生物药物生产过程中的 宿主生物。由于它们可能影响产品安全性 和功效，因此根据法规要求必须对药品 中的 HCP 进行监测和控制[1]。传统上， 酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 是定量分析 蛋白质治疗药物中 HCP 的标准方法。然 而，ELISA 的特异性和覆盖率不足以鉴定 并定量分析各种 HCP。因此，LC-MS 技 术成为 HCP 分析的另一选择。在 HCP 的 LC/MS 定量分析过程中，主要挑战在于 低丰度 HCP 肽段与高丰度药品肽段的共 洗脱。因此需要在药品基质的高背景下对 低丰度肽进行灵敏而可重现的定量分析。 本应用简报介绍了用于宿主细胞蛋白质高 灵敏度定量分析的完整工作流程解决方 案，包括： • 用于样品自动前处理的 Agilent AssayMAP Bravo 平台 • 用于样品分离的 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪 • 用于数据采集的 Agilent 6495C 三重 四极杆 LC/MS 系统 • 用于 MRM 方法开发的 Skyline 软件 中的安捷伦自动化工具 • 使用 Agilent MassHunter 定量分析软 件和 Skyline 软件进行数据处理 使用基于多反应监测 (MRM) 的同位素稀 释方法，结果显示可准确定量低至亚 ppm (ng/mg) 浓度的 HCP。

实验部分 仪器 • Agilent AssayMAP Bravo 系统 (G5571AA) • Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统 包括： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备样品冷却装置选件 （选件 100） • Agilent 1290 Infinity II 柱温箱 (G7116B) • Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统 • 安捷伦喷射流 ESI 离子源 (G1958-65138)

材料 人 IgG1 mAb（来自合作伙伴的一种研发 产品）由中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞产生， 并经过 Protein A 纯化。重型稳定同位素 标记 (SIL) 肽标准品由第三方供应商定制 合成（表 1）。所有 SIL 肽经 HPLC 纯化， 质量通过 LC/MS 和氨基酸分析测定。

样品前处理 使用 AssayMAP Bravo 系统进行 mAb 样 品变性、还原、烷基化和胰蛋白酶解。 将 SIL 肽以等摩尔浓度混合，并以 8 种 不同浓度（每种 SIL 肽浓度为 6.25、 12.5、25、62.5、125、250、12500、 125000 amol/µg）加入样品酶解物中， 用于定量分析。

LC/MS 分析 使用 9 分钟液相色谱梯度，通过 6495C 三重四极杆 LC-MS 在 dMRM 模式下分 析样品。表 1 和表 2 详细列出了色谱和 质谱分析的实验条件。使用与 Skyline 和 Agilent MassHunter 工作站软件集成的安 捷伦自动化工具对 LC-dMRM 方法进行自 动优化。

数据处理 使用 Agilent MassHunter 工作站软件和 Skyline 软件进行多肽定量的数据分析。

结果与讨论

LC-dMRM 方法开发 为了评估 HCP 分析的定量性能，使用 AssayMAP Bravo 自动化系统使纯化的 mAb 经历变性、还原、烷基化和胰蛋白 酶酶解。将该样品酶解物在以下实验中用 作 mAb 背景基质。将三种 SIL 标准肽加 入样品酶解物中进行标准曲线分析，包括 两种与 SUMO1 和 SYHC 外源蛋白匹配的 肽和一种与内源性 HCP（即 CHO 蛋白质 S100-A11）匹配的肽（表 3）[2]。所有 SIL 肽标准品的纯度大于 95%。 使用 MassHunter 和 Skyline 自动化工作 流程优化 LC-dMRM 方法（图 1）。在此 工作流程中，首先在 Skyline 软件中创建 目标肽段和离子对。使用自动化工具自动 创建和执行 MRM 方法和任务列表，以确 定多肽保留时间，优化碰撞能量，分析数 据并导出最终 LC/MS 方法[3]。

mAb 基质中 SIL 肽标准品的定量分析 在 mAb 背景基质中评估定量分析三种 SIL 肽标准品的灵敏度性能。空白进样建 立系统清洁度后，对所有浓度进行重复进 样 (n = 5)，浓度范围为 6.25 amol/µg 至 125 fmol/µg，每次进样的载样量为 8 µg （表 4）。所有目标蛋白质的标准曲线范围 从低至亚 ppm 到超过 1000 ppm，涵盖 了与 HCP 分析相关的较宽范围。确定了 所有样品 (n = 40) 的保留时间 (RT) 重现 性，以及每种浓度的峰面积重现性和定量 分析准确度：

• 所测试的浓度具有出色的线性， LLLEYLEEK 的 R2 = 0.9993，VFDVIIR 的 R² = 0.9990，DPGVLDR 的 R2 = 0.9995（图 2A 至图 4A） • 所有浓度均表现出出色的精度和准确 度，包括定量下限 (LLOQ)（表 4）

• 全部三种蛋白质在低浓度下具有高灵 敏度，LLOQ 低至亚 ppm 级（图 2B 至图 4B 和表 4，SUMO1_HUMAN 为 0.48 ppm，SYHC_HUMAN 为 0.7 ppm，CHO 蛋白质 S100-A11 为 0.13 ppm）

• SIL 肽 VFDVIIR 和 DPGVLDR 存在一 些背景基质干扰。即便如此，目标蛋 白质仍获得了亚 ppm 的 LLOQ（图 3B 和图 4B）

• 所有 40 次进样均具有出色的 RT 重 现性（LLLEYLEEK 的 RSD = 0.06%， VFDVIIR 的 RSD = 0.08%，DPGVLDR 的 RSD = 0.47%）

本实验所用色谱柱的载样容量大于 8 µg[2]。 因此，如由需要，可柱上进样更高载样量 来实现更低的 LLOQ 浓度。

对蛋白质进行绝对定量分析 生物药物生产过程中需要监测和控制宿主 细胞蛋白质杂质浓度。在此过程中，测量 目标 HCP 的绝对浓度十分重要。只要有 合适的参比标样，基于质谱的分析对该应 用具有很高的特异性和准确性。由于 SIL 标准肽的可用性和成本，与目标蛋白质序 列相匹配的 SIL 标准肽被广泛应用于绝对 定量分析。

我们对先前 HCP 发现工作中鉴定出的内 源性 HCP（即 CHO 蛋白质 S100-A11） 进行了绝对定量分析[2]。采用两种方法计 算绝对蛋白质浓度。在第一种方法中， 使用了内源性肽 DPGVLDR 的平均响应和 图 4A 中的标准曲线方程确定肽的绝对浓 度。在第二种方法中，使用相同 LC/MS 运行中的轻型肽和重型肽之间的响应比来 确定内源性肽浓度（图 5）。与预期结果相同，这两种方法产生了类似的 CHO 蛋 白质 S100-A11 的蛋白质浓度（1.05 与 1.47 ppm）。这些结果进一步证明了： • 安捷伦 HCP 发现工作流能够鉴定个 位数 ppm 级的 HCP[2] • 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统是一 种可靠的低浓度肽定量分析方法

结论 本文展示了用于 HCP 定量分析的安捷伦 工作流程解决方案的性能。采用以任务为 中心的自动化方案的 AssayMAP Bravo 平 台为样品前处理自动化带来了的重现性、可扩展性、灵活性和简便易 用性。Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪 是新一代 UHPLC 系统，具有更出色的色 谱分离度和保留时间精度。Skyline 软件 和 Agilent MassHunter 软件无缝集成， 结合使用自动化工具为优化 LC-dMRM 方 法提供了简单的解决方案。使用 Agilent 6495C 三重四极杆 LC/MS 系统证明了 亚 ppm 级浓度 HCP 的准确定量分析。 Skyline 和 MassHunter 软件的结合已证 明是靶向数据分析的工具。