超高效液相色谱-串联质谱法测定燕窝中的激素类药物

介绍：燕窝为雨燕科金丝燕属及多种同属燕类分泌出来的唾液，与其绒毛混合凝结所筑成的巢窝。燕窝是一种名贵的滋补佳品和高级宴席佳肴，药食皆宜，且美容养颜的功效，深受女性消费者的喜爱。激素类化合物常被非法添加于化妆品及一些具有美容养颜的保健品中，人体从外界摄入大量激素物质后 , 才会造成体内激素代谢的紊乱，严重影响人们的健康。为了预防和监测此类非法添加的食品安全事件，亟需建立燕窝中激素类的检测方法。本文建立超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测雌激素和孕激素药物在燕窝中的含量，且具有前处理简单，灵敏度高和结果可靠的特点。

实验方法：样品前处理准确称取 0.5 g 的样品于离心管中，加入 4 mL 水，涡旋混匀，静置复水 30 min。加入 5 mL 乙腈，超声提取10 min，6000 rpm 下离心 5 min。移取上清液至洁净的试管中，在 45℃下氮吹至约为 1 mL。加入 5mL 水，混匀后待净化。C18 SPE 小柱使用前依次用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化。将上述提取液转移至 C18 固相萃取柱，弃去流出液，用 5 mL10% 甲醇水溶液和 5 mL 水淋洗小柱，负压抽干。用 3 mL 甲醇洗脱，洗脱液氮吹至干，用 0.5 mL 乙腈水溶液定容，过 0.22 µm 微孔滤膜，供 LC-MS/MS 测定

LC-MS/MS 仪器方法本实验液相色谱仪为 PerkinElmer AltusTM A-30 UPLC® 系统，色谱柱为 PerkinElmer SPP C18 2.1*50 mm, 2.7 um（货号：N9308402）。流动相A为乙腈，流动相B为水（正离子模式：含 0.1% 甲酸；负离子模式：0.01% 氨水）。柱温：35℃，洗脱条件：梯度洗脱见表 1

标准曲线采用乙腈水溶液 (V/V, 1:2) 作为稀释液，将标准储备液配制成工作液，使各个化合物浓度为 0.1-100 ng/mL，雌三醇浓度为 0.5-100 ng/mL，标准工作液现配现用。数据采集与处理本实验数据软件为 PerkinElmer Simplicity Acquisition ™，数据处理软件为 Simplicity Quant ™ software。

结果与讨论样品前处理优化为了获得良好的实验结果，本研究在样品前处理进行了一系列的优化，如提取溶剂体积、超声提取时间、淋洗液溶剂比例以及洗脱液洗脱体积等影响因素。实验结果表明，淋洗液甲醇水的比例对实验结果有显著的影响，见图 1. 从图 1 中，可以得到 10% 甲醇水作为淋洗液获得良好的回收率。

标准校正曲线与回收率实验按照上述建立的实验条件，获得孕激素类（浓度为 0.05 ng/mL）和雌激素类（0.2 ng/mL）的色谱图，见图 2。各激素类化合物的信息、保留时间以及低浓度下信噪比见表 5。在本方法确定的实验条件下，获得标准曲线数据。以进样浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，建立标准曲线。图 3 为激素化合物中 21 a- 羟基孕酮的标准曲线示例。表 6 为各个激素化合物的线性范围、定量限（LOQ）和 RSD 实验数据。激素类化合的定量限（LOQ）在 0.01-0.2 mg/kg，各分析物标准曲线的相关系数均大于 0.993，相关性良好。表 6 中展示了目标化合物在低浓度下的重现性实验，获得优异的重现性结果，RSD 值在 2.05%-7.88% 之间。

在优化条件下，对燕窝样品进行添加标准回收实验，添加浓度水平为 0.5、2.0 和 10.0 mg/kg，加标回收率实验结果见表 7。燕窝样品中激素类化合物的回收率良好，范围在60.5%-99.5% 之间。

结论本文采用超高效液相色谱 - 串联质谱技术建立了燕窝中15 种激素类药物含量的检测，通过单次提取即可得到雌激素和孕激素化合物。本方法前处理简单，快速，灵敏度高，回收率良好以及优异的重现性，满足燕窝中激素类化合物的日常检测要求。