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做寡核苷酸 LC/MS 的人，都在偷偷用这根“作弊神器”
为什么寡核苷酸 LC/MS 分析
容易被“金属”困扰？
在寡核苷酸的 LC/MS 分析中，分析人员经常会遇到一些“并非来自样品本身”的困扰，例如：
峰面积不稳定、回收率偏低；
色谱峰拖尾；
质谱中出现大量复杂的加合峰，导致数据解读困难。
这些问题的一个重要来源，是金属离子与寡核苷酸之间的相互作用。
一方面，传统 HPLC 系统和色谱柱中普遍使用不锈钢部件，暴露的铁离子位点可能吸附带强负电荷的寡核苷酸分子；另一方面，样品或溶剂体系中常见的钠、钾等碱金属离子，也极易与寡核苷酸形成加合物，使质谱图变得复杂。
为减少这类干扰，研究团队引入了安捷伦超高惰性（Ultra Inert, UI）色谱柱硬件，并结合完全生物兼容的液相系统，对寡核苷酸在不同分析条件下的表现进行了系统比较。
实验条件参数
围绕“金属控制”的整体设计
01
样品与前处理
测试样品包括：
25 mer DNA
50 mer DNA
样品均溶解于新制超纯水中，配置为 1 mg/mL。
实验中全程使用聚丙烯（PP）溶剂瓶，以降低溶液中碱金属离子的引入风险。
02
色谱与质谱系统
液相系统：Agilent 1290 Infinity II 系列
质谱系统：Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF LC/MS
对比色谱柱：
不锈钢结构的寡核苷酸色谱柱
Altura Oligo HPH-C18 超高惰性涂层色谱柱
03
分析方法设置
实验分别考察了两种分析策略：
离子对反相色谱法（以胺类 / HFIP 为离子对体系，负离子检测）；
无离子对反相方法（以碳酸氢铵体系为流动相，正离子检测）。
同时，对流速、梯度和清洗步骤进行了系统优化，以更真实地评估金属离子对分析结果的影响。
数据结果分析
从峰面积到质谱清晰度的改变
1. 金属吸附对回收率与灵敏度的影响
在连续进样实验中可以观察到，使用传统不锈钢色谱柱时，首次进样的峰面积明显偏低。这表明寡核苷酸容易被柱内金属位点吸附。
而在采用超高惰性涂层色谱柱后，峰面积在初始进样阶段即保持稳定，有助于获得更可靠的定量结果。
图 1. 不同色谱柱条件下，寡核苷酸峰面积随进样次数变化的对比趋势
2. 色谱柱材质对离子对反相质谱数据解析的影响
即便样品经过离子交换纯化，质谱中仍然检测到明显的钠、钾加合物信号。这些离子可能来源于：
样品溶解用水；
溶剂体系；
实验室常规玻璃器皿。
在离子对反相条件下，质谱中可观察到多种加合形式，使原本清晰的电荷态分布变得复杂。
相比之下，结合超高惰性色谱柱与优化条件后，原始质谱图加合峰显著降低，解卷积后的分子量更接近理论值，为后续结构确认和杂质分析提供了更高的可信度。
图 2. 25 mer DNA 在不同色谱条件下的质谱与解卷积质量对比示意
我们将相同梯度条件与优化后的低流速应用于较大的 DNA 寡核苷酸(50mer)分析。结果显示，随着寡核苷酸链长增加，所呈现的电荷态数量明显增多。低电荷态更容易出现金属加合干扰。同时，经解卷积处理后的质谱图中加合物信号也显著减少。
图 3A. 采用离子对反相色谱法 (0.21 mL/min) 获得的 50 mer DNA 的紫外色谱图
图 3B. 采用离子对反相色谱法 (0.21 mL/min) 获得的 50 mer DNA 的质谱图 (FBF) 和解卷积质谱图
3. 无离子对反相方法的表现趋势
在某些情况下，无离子对分析条件更具优势，尤其是在需要避免使用 HFIP 的情况下。无需使用 HFIP 的无离子对替代方法条件下，检测模式由负离子转为正离子，可以观察到加合物水平整体下降，谱图更“干净”。
图 4. 不同分析策略下，25mer 和 50merDNA 的整体质谱表现对比
结语
Altura Oligo HPH-C18
超高惰性色谱柱的核心优势
综合不同样品类型与分析条件，本研究表明：
超高惰性涂层设计可显著降低金属吸附，改善寡核苷酸回收率；
峰形与峰面积更稳定，有助于提升定量重复性；
在 LC/MS 应用中，可有效减少金属离子加合物带来的质谱复杂度；
兼容离子对与无离子对反相策略，为用户在 HFIP 使用受限时提供灵活替代方案；
解卷积质量结果更接近理论值，MS 准确度更高。
对于从事寡核苷酸结构表征、杂质分析及方法开发的分析人员而言，在色谱柱硬件层面“提前消除金属干扰”，往往比事后复杂的数据处理中更高效、更可靠。
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