【学术前沿】三种样品处理方法下MALDI-TOF鉴定丝状真菌效果比较

背景：

丝状真菌引起的侵袭性感染是免疫功能低下患者发病和死亡的主要原因。快速、准确地鉴定丝状真菌对于及时启动合适的抗真菌治疗至关重要。传统的鉴定方法（基于形态学）耗时且依赖专家经验，而分子技术（如测序）成本高、速度慢，限制了其在常规诊断中的应用。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已成为细菌和酵母菌快速鉴定的有效工具，并逐渐应用于丝状真菌的鉴定。然而，其鉴定成功率受数据库覆盖度和样本制备方法的影响。

目的

Ø 评估并比较制造商推荐的三种不同样本制备方法（改良直涂法、提取法、液体培养法）对230株丝状真菌分离株在属和种水平上的鉴定率影响。

Ø 验证一个内部设定的、更低的种水平鉴定阈值（logscore ≥1.70）是否能在不增加错误鉴定的前提下，提高种水平的正确鉴定率。

实验方法

Ø 研究对象：230株丝状真菌分离株（185株临床分离株 + 45株参考菌株），均通过传统形态学方法（部分辅以ITS2区域测序）进行鉴定。

Ø MALDI-TOF MS平台：使用商业微生物质谱系统及其商业化的丝状真菌数据库。

Ø 样本制备：对每株分离株分别采用三种方法：

改良直涂法 (Extended direct transfer)：简单快速的方法。5分钟

提取法 (Extraction)：通过乙醇/甲酸处理提取蛋白质，步骤更复杂。15分钟

液体培养法 ：先在液体培养基中培养，再进行提取，最为耗时。24小时

结果判读：

Ø 制造商标准：logscore ≥2.0为高可信度（种水平），1.70-1.99为低可信度（属水平），<1.70为无法鉴定。

Ø 内部标准：将种水平鉴定的阈值降低至 logscore ≥1.70。

Ø 验证：将MALDI-TOF MS的鉴定结果与传统方法（金标准）的结果进行比对，评估正确率和错误率。

实验结果

Ø 样本制备方法的影响：

更复杂的样本制备方法显著提高了种水平的鉴定率。改良直涂法：种水平鉴定率为48.9%。提取法：种水平鉴定率提升至 62.0%。液体培养法：种水平鉴定率达到最高的 76.1%。在所有情况下，均未发生错误鉴定（即没有将A菌鉴定为B菌）。

图1.使用三种不同样本提取方法对菌种进行 MALDI-TOF  MS 结果分析（部分）

Ø 内部阈值（≥1.70）的效果：

应用更低的阈值后，种水平的正确鉴定率进一步大幅提升。使用液体培养法结合内部阈值，种水平鉴定率最高可达 86.4%。

         图2.三类提取方法鉴定成功率比对

大微实验室验证：

依据文献中的技术路线，本实验室采用DW-MS 5500系统对黑曲霉Aspergillus niger进行改良直涂法和提取法分别进行处理，从谱图和系统评分可直观判断两种方法的鉴定表现；改良直涂法并不能很好的将黑曲霉胞内的蛋白提取出，从而导致特征峰无法被仪器收集，评分低于<1.70判定为鉴定失败；而提取法使得胞内容物更多被析出，鉴定结果置信度高且特征峰明显。

图3.改良直涂法鉴定谱图（大微实验室测试结果）

图4.提取法鉴定谱图（大微实验室测试结果）

实验结论 

Ø MALDI-TOF MS平台适用性：结合商业数据库和标准化的样本制备流程，MALDI-TOF MS能够实现对丝状真菌的高准确率鉴定，适用于常规实验室检测。

Ø 样本制备策略：遵循制造商推荐的分步策略（先用改良直涂法，如鉴定失败后再用提取法）进行样本制备是有效的，因为操作上更复杂的制备方法（提取法）能显著提高丝状真菌的鉴定成功率。

Ø 内部阈值验证：将丝状真菌的种水平鉴定阈值从≥2.0降低至≥1.70是安全且有效的。该策略能显著提高种水平的鉴定率，同时几乎不引入错误鉴定（仅一例可解释的轻微错误）。因此，该内部阈值可以在常规实验室检测中被采纳和应用。