单克隆抗体 N-糖基化的毛细管电泳和质 谱分析

前言近年来，单克隆抗体 (mAb) 已成为生物制药行业具有潜力的新兴蛋白候选药物。其药物研发流程包括一系列精细的控制和评估步骤，需要仔细、严格地监测目标化合物的治疗稳定性及有效性。因此，在商业化前的每个阶段对 mAb 进行全面表征是极其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻译后修饰中，已知糖基化在很多生物过程中都扮演着重要的角色（例如蛋白降解和转录），从而影响健康和疾病进展1。而鉴定重要蛋白分子中连接的糖基则需要一种可靠、稳定、灵敏的分析技术。近来，毛细管电泳 (CE) 在糖蛋白分析领域得到了众多关注，主要是由于其可以缩短分析时间，并保持高效分离。使用一种荧光发色团（ATPS，阴离子）对酶解所得多糖进行标记，CE 分离后，利用高灵敏度的激光诱导荧光 (LIF) 或质谱 (MS)进行检测。APTS 标记将负电荷传递给多糖，可提高电泳分离能力，并使之更适用于电喷雾电离（负模式），使整个分离和检测过程与荧光标记化学高度兼容。将CE 与 MS 串联有益于鉴定未知的糖基化修饰或质量信息，并进行峰指认2。本应用简报展示了利用 CE-QTOF MS 对重组 mAb 所得的 N-糖基进行分析。APTS 标记的 CE-MS 方法有助于鉴定 mAb 上的所有糖基。此外，还可得到每种多糖的相对百分比，以表征主要及次要糖基化修饰。

前言近年来，单克隆抗体 (mAb) 已成为生物制药行业具有潜力的新兴蛋白候选药物。其药物研发流程包括一系列精细的控制和评估步骤，需要仔细、严格地监测目标化合物的治疗稳定性及有效性。因此，在商业化前的每个阶段对 mAb 进行全面表征是极其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻译后修饰中，已知糖基化在很多生物过程中都扮演着重要的角色（例如蛋白降解和转录），从而影响健康和疾病进展1。而鉴定重要蛋白分子中连接的糖基则需要一种可靠、稳定、灵敏的分析技术。近来，毛细管电泳 (CE) 在糖蛋白分析领域得到了众多关注，主要是由于其可以缩短分析时间，并保持高效分离。使用一种荧光发色团（ATPS，阴离子）对酶解所得多糖进行标记，CE 分离后，利用高灵敏度的激光诱导荧光 (LIF) 或质谱 (MS)进行检测。APTS 标记将负电荷传递给多糖，可提高电泳分离能力，并使之更适用于电喷雾电离（负模式），使整个分离和检测过程与荧光标记化学高度兼容。将CE 与 MS 串联有益于鉴定未知的糖基化修饰或质量信息，并进行峰指认2。本应用简报展示了利用 CE-QTOF MS 对重组 mAb 所得的 N-糖基进行分析。APTS 标记的 CE-MS 方法有助于鉴定 mAb 上的所有糖基。此外，还可得到每种多糖的相对百分比，以表征主要及次要糖基化修饰。

CE-MS 仪器方法CE-ESI-MS 分析中使用 7100 CE 系统（配有CE-MS毛细管卡套，部件号 G1603A），串联 6520 精确质量 Q-TOF（配有双离子源及正交共轴鞘液接口，部件号 G1607B）3。使用空缓冲液和标准品优化分离条件和喷雾稳定性。鞘液 CE-MS 接口处维持一个较低的流速 (5 µL/min) 以保持 CE 分离的高效性，并为电喷雾电离提供一个稳定流及其它必要的喷雾条件。Q-TOF 参数由MS 调谐系统自动优化，并利用 ESI 调谐混合物对 MS 系统进行校正。

表 1 列出了 CE-MS 的参数。所有化合物列表由 MassHunter 分子特征提取 (MFE)算法提取所得。

结果与讨论尽管 CE-LIF 常用于多糖分析，但 CE-MS能提供分子量信息，所以在鉴定电泳结果中的未知迁移条带方面具有优势。在本应用简报中，将 CE 与配有鞘液接口的 Q-TOF MS 串联，以指认 mAb 所得多糖的质量信息。方案 1 描述了 mAb 糖谱的 CE-MS 分析步骤。简单地说，抗体释放的多糖先进行 APTS 标记，然后进行 CE-MS 分析。图 1 为重组 mAb 中释放所得的 N-糖基的 CE-MS 总化合物谱。利用 PVA 涂层毛细管，所有 mAb 多糖均可在 15 分钟分离时间内实现迁移。通过重复实验，我们成功鉴定了未带电荷的N-糖基类化合物，包括 G0、G0F、G1、G1F、G2 和 G2F。此外，还观察到了单唾液酸化的多糖 G2F+1NANA。所有峰的指认均基于 Q-TOF 分析测得的精确分子量。

表 2 总结了本研究中鉴定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鉴定出 G2类，但 LC/MS 分析中并未鉴定出（数据未列出），表明基于 CE-MS 的分析有显著优势（即 CE-MS 的互补价值）。

表 2 总结了本研究中鉴定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鉴定出 G2类，但 LC/MS 分析中并未鉴定出（数据未列出），表明基于 CE-MS 的分析有显著优势（即 CE-MS 的互补价值）。

表 2 总结了本研究中鉴定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鉴定出 G2类，但 LC/MS 分析中并未鉴定出（数据未列出），表明基于 CE-MS 的分析有显著优势（即 CE-MS 的互补价值）。

很敏感。通过计算相对于总化合物峰容量的百分容量，可对 mAb 释放所得的多糖进行相对定量，结果如表 2 所示。在本例中，G2+1NANA 是糖型中的主要形式。

这些结果清晰地指出 CE-MS 可成为检测糖谱的一种有效的替代分析工具。串联CE-MS 分离可避免污染，这是因为样品处理步骤很少，CE 分离使用的缓冲液与电喷雾电离高度兼容。与 CE-LIF 相比，该方法在糖谱分析中更为灵敏、精确。

结论本应用简报提供了一个基于 Agilent CE-MS的 mAb糖谱分析方法。Agilent MassHunter和 BioConfirm 软件包的强大数据处理能力能够成功、详尽地鉴定并得出 mAb 糖型谱。此外，通过分离主要和次要多糖形式，可合理解析糖基化模式。